研究目的：　　结直肠癌是一种世界范围内常见的恶性肿瘤之一。全世界每年大约有1400，000人被诊断出患有结直肠癌，约有700，000病人直接或者间接死于结直肠癌。大部分早期的结直肠癌病人可以通过外科手术治疗得到痊愈。不幸的是，结直肠癌病人大多数被确诊出来时已经中晚期了，所以预后比较差。因此研究结直肠癌发生发展的潜在分子机制，为结直肠癌病人寻找新的分子标记物和有效的治疗策略意义重大。　　CDCA3，又称Tome-1，是细胞在进行有丝分裂过程中所必需的一种周期相关蛋白，其调控着细胞周期的进展。它可以通过淘汰素(cullin-1)、S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase-associatedprotein1，SKP1)共同参与E3连接酶复合物的构成，与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、有丝分裂抑制激酶家族成员Wee1的泛素化与降解相关，它是细胞进入有丝分裂的触发器，同时CDCA3也参与细胞周期G1期的调控。近年来，研究发现CDCA3在前列腺癌、肺癌、口腔鳞癌等肿瘤中出现异常高表达的现象，并且表明其可能在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用，但是在结直肠癌中的研究尚未见报道。本课题旨在探讨CDCA3蛋白在结直肠癌中的作用及其分子机制，为结直肠癌的诊断及治疗提供新的可能的分子靶标。　　研究方法：　　1.CDCA3在结直肠癌组织及细胞中的表达　　采用荧光实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测CDCA3在32例结直肠癌组织及其配对的正常组织标本中的表达情况。检测结肠癌细胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、RKO、Caco-2、HCT116和永生化结肠上皮细胞FHC中CDCA3的表达。　　2.CDCA3对结直肠癌体内外生物学特性的影响　　(1)购买了CDCA3稳定干扰的慢病毒载体及构建CDCA3过表达的质粒，经测序鉴定，结果显示无突变、缺失、序列完全正确。将病毒转染至SW480和SW620细胞中，建立稳定干扰CDCA3表达的SW480和SW620细胞亚系。将过表达质粒转染至SW620、Caco-2细胞系中，构建瞬时过表达CDCA3的细胞亚系。并用qRT-PCR及westem blot的方法进行验证。　　(2)通过CCK8细胞增殖实验，平板克隆实验，细胞周期及凋亡细胞实验，实验检测干扰或过表达CDCA3的细胞株体外增殖和抗凋亡能力。　　(3)将已构建成功的稳定干扰细胞株SW620-pLV-CDCA3和SW620-PLV-shNC注射至裸鼠皮下，20天后检测肿瘤的大小以观察CDCA3稳定干扰的细胞株在体内的增殖能力。　　3.CDCA3对NF-κB通路活性的调节作用　　(1)通过GSEA基因富集的方法，利用公共数据库GEO数据分析结直肠癌CDCA3高表达组中上调的信号通路（NF-κB信号通路）。　　(2)通过NF-κB双荧光素酶报告基因检测NF-κB活性改变。　　(3)Westernblot检测NF-κB通路相关基因的改变。　　(4)利用蛋白的核浆分离和细胞免疫荧光，检测CDCA3改变后P65入核量的改变。　　4.CDCA3与TRAF2相互作用并通过其调节经典NF-κB通路　　(1)利用免疫共沉淀和免疫共聚焦实验，分析CDCA3与TRAF2是否存在相互作用。　　(2)通过western blot，分析CDCA3如何调控TRAF2并影响NF-κB通路。　　5.CDCA3调控NF-κB下游相关靶基因Cyclin D1的表达　　(1)通过实时荧光定量和免疫印迹技术，检测CDCA3对NF-κB靶基因cyclin D1的影响。　　(2)加NF-κB通路抑制剂Bay11-7082，利用荧光定量和免疫印迹技术检测Cyclin D1表达的改变。　　6.统计学分析　　采用SPSS20.0软件进行对数据进行统计学分析。两组间比较用独立样本的t检验，数据表示为3次独立实验的均数±标准差的形式。如果是三组以上进行比较用单因素方差分析的方法(One-Way ANOVA)，用LSD和SNK方法进行比较。CDCA3表达情况和临床病理参数之间的关系采用x2检验。CDCA3与Cyclin D1之间的相关性采用Spearman进行分析。　　研究结果：　　1.CDCA3在结直肠癌组织和细胞中表达上调且与结直肠癌的浆膜浸润、TNM分期正相关。　　(1)CDCA3在结直肠癌组织和细胞中表达上调　　荧光定量RT-PCR结果显示，在32对结直肠癌组织中，CDCA3在结直肠癌组织中的表达有27对高于周围正常肠粘膜组织(P＜0.001)。在结直肠癌细胞SW480、SW620、HT29、HCT116中CDCA3的表达均高于永生化结肠细胞FHC(P＜0.05).　　(2)CDCA3表达水平和临床病理参数之间的关系　　临床病理分析结果显示，CDCA3的表达水平在年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移和分化上没有显著差异(P＞0.05)，而在TNM分期、浆膜浸润上有差异且具有统计学意义(P＜0.05)。　　2.干扰CDCA3对结直肠癌细胞增殖、抗凋亡、细胞周期的影响。　　(1)CDCA3干扰载体的构建　　构建了CDCA3干扰的慢病毒载体，经测序鉴定结果显示插入的序列正确，无突变、缺失或者框移。慢病毒载体转染结直肠癌细胞株构建CDCA3稳定干扰细胞株SW480-pLV-shCDCA3、SW480-PLV-shNC和SW620-pLV-shCDCA3、SW620-PLV-shNC，经WB和QRT-PCR检测CDCA3表达与对照组相比明显降低(P＜0.001)。　　(2)CDCA3干扰对结直肠癌细胞增殖能力的影响　　CCK8结果显示，与对照组相比CDCA3稳定干扰的细胞生长速度显著下降(P＜0.001)，过表达CDCA3，则出现相反的结果(P＜0.001)。平板克隆形成实验结果显示，与对照组相比CDCA3稳定干扰的细胞形成的克隆数量显著减少(P＜0.05)。　　(3)CDCA3干扰对结直肠癌细胞周期与凋亡的影响　　流式细胞学结果显示，与对照组相比，CDCA3稳定干扰细胞在G1期数量显著增多(P＜0.05);同时，与对照组相比，稳定干扰CDCA3可诱导细胞早期凋亡(P＜0.05);同时，检测凋亡相关的蛋白caspase3和PARP，结果显示干扰CDCA3后水解激活的caspase3和PARP增多，总caspase3和PARP水平没有变化。　　(4)CDCA3在体内对结直肠癌细胞生长能力的影响　　裸鼠皮下成瘤实验结果显示，与对照组相比，稳定干扰CDCA3后，细胞在裸鼠体内生长能力明显得到抑制(P＜0.05)。免疫组化结果显示，与对照组相比，稳定干扰CDCA3后细胞的Ki-67指数明显下降(P＜0.05)。　　3.CDCA3参与经典NF-κB通路的调控。　　(1)NF-κB双荧光素酶实验结果显示，与对照组相比，干扰CDCA3可以减少NF-κB通路的活性，相反过表达CDCA3后，可以促进NF-κB通路的激活(P＜0.05)。利用免疫印迹实验检测了NF-κB通路相关的蛋白，结果显示，干扰CDCA3后，IKKα，IKKβ和p-P65出现下调，而过表达CDCA3后出现上调的现象。　　(2)免疫荧光实验结果显示，与对照组相比，过表达CDCA3可以促进p65入核;同时核浆分离实验结果证实，干扰CDCA3后使P65细胞核聚集减少。　　4.CDCA3与TRAF2相互作用并通过其调节经典NF-κB通路　　(1)免疫荧光共聚焦实验结果显示，CDCA3与TRAF2出现共定位现象;免疫沉淀实验结果证实，CDCA3与TRAF2蛋白存在互拉现象。　　(2)免疫印迹实验显示，干扰CDCA3可以下调TRAF2的蛋白水平的表达，而过表达CDCA3后出现上调的现象。与此同时，在过表达CDCA3细胞株中，干扰TRAF2可以消除CDCA3对NF-κB通路的调控效应。　　5.CDCA3调控NF-κB下游相关基因Cyclin D1的表达　　(1)免疫印迹和QRT-PCR实验结果显示，干扰CDCA3可以下调Cyclin D1，上调P21，而过表达CDCA3可以上调Cyclin D1，下调P21。　　(2)添加NF-κB通路抑制剂Bay11-7082后，可以在转录水平和蛋白水平同时下调Cyclin D1　　(3)24对肠癌组织中验证了CDCA3与Cyclin D1转录水平的表达具有正相关性。　　研究结论:　　1.CDCA3在结直肠癌组织中高表达，且与浆膜浸润和TNM分期正相关，在结直肠癌中可能发挥癌基因的作用。　　2.干扰CDCA3表达抑制结直肠癌细胞的增殖、抗凋亡能力及细胞周期。　　3.CDCA3正向调节经典的NF-κB通路活性　　4.CDCA3与TRAF2相互作用并通过其调节NF-κB通路活性。　　5.CDCA3可以通过NF-κB通路调节Cyclin D1的表达。