结直肠癌(Colorectal Cancer)是目前世界上最常见的癌症之一。当前结直肠癌治疗的主要策略主要是手术治疗结合放射性治疗及化学治疗。但是随着化学治疗中化疗药物长时间的使用,化疗效果会明显减弱,寻找天然产物或药物来与之联合应用,进而增强化疗药物的化疗功效是当前临床应用中比较重要的治疗策略。黑树莓具有独特的多酚成分,以花青素为主。我们前期研究结果发现,黑树莓花青素可作为结直肠癌有效的化学预防剂,通过对Wnt通路相关信号分子启动子甲基化水平进行调控,从而对结直肠癌肿瘤的发生发展具有明显延滞作用。本课题拟将黑树莓花青素与目前一线化疗药物(五氟尿嘧啶、塞来昔布、奥沙利铂、喜树碱)联合应用,作用于结直肠肿瘤细胞及结直肠癌动物模型,考察其联合应用对上述药物的协同作用,并对黑树莓花青素联合化疗药物后产生协同作用的可能机制进行初步探究,结果如下:1、体外实验:1.1 MTT法检测临床上常用的化疗药物五氟尿嘧啶、塞来昔布、奥沙利铂、喜树碱单独或分别与黑树莓花青素联合应用对结直肠肿瘤细胞生长的作用。结果发现,五氟尿嘧啶、塞来昔布、喜树碱和奥沙利铂单独给药处理SW480细胞的存活率分别为65%,75%,78%,75%,分别联合黑树莓花青素给药后,细胞存活率仅为30%,50%,70%,50%。五氟尿嘧啶、塞来昔布、喜树碱和奥沙利铂单独给药处理Caco2细胞的存活率分别为75%、78%,80%,65%,分别联合黑树莓花青素给药后,细胞存活率仅为40%,60%,50%,50%。上述结果提示:五氟尿嘧啶、塞来昔布、奥沙利铂、喜树碱联合黑树莓花青素后能够显著抑制结直肠癌细胞的生长。1.2平板克隆实验检测结直肠癌细胞的集落形成能力。五氟尿嘧啶单独或联合黑树莓花青素处理SW480细胞48小时,培养15天后发现,空白组细胞克隆形成数平均约为290个,五氟尿嘧啶单独给药组的细胞克隆形成数平均约为125个,五氟尿嘧啶联合黑树莓花青素给药组的细胞克隆形成数平均约为40个。依照同样的处理方式,塞来昔布单独或联合黑树莓花青素处理SW480细胞,空白组细胞克隆形成数平均约为280个,塞来昔布单独给药组的细胞克隆形成数平均约为180个,塞来昔布联合黑树莓花青素给药组的细胞克隆形成数平均约为60个。上述结果提示:五氟尿嘧啶、塞来昔布联合黑树莓花青素给药后能够显著抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力。1.3 Western Blot实验检测五氟尿嘧啶、塞来昔布、奥沙利铂、喜树碱单独或分别与黑树莓花青素联合处理后,结直肠肿瘤细胞中AKT,磷酸化AKT(p-AKT),HIF-1α分子蛋白的表达变化。五氟尿嘧啶单独或与黑树莓花青素联合后,检测组蛋白甲基转移酶(EZH2),H3K27me的蛋白表达变化。结果发现:和单独给五氟尿嘧啶、塞来昔布、奥沙利铂、喜树碱相比,联合黑树莓花青素给药后p-AKT、HIF-1α相关分子的蛋白表达水平也呈现更为显著的下调趋势;和单独给五氟尿嘧啶相比,联合给药组中EZH2和H3K27me蛋白表达水平下调更加明显;抑癌因子PTEN的蛋白水平表达明显上调。2.体内实验:2.1五氟尿嘧啶、奥沙利铂单独后分别联合黑树莓花青素对AOM诱导原发性结直肠癌小鼠肿瘤多样性的影响。14周后小鼠建模成功,成瘤率为100%。模型组小鼠肿瘤平均数目为8,单独给五氟尿嘧啶的治疗组小鼠肿瘤平均数目为6,联合黑树莓花青素给药治疗组小鼠肿瘤平均数目仅为4;单独给奥沙利铂的治疗组小鼠肿瘤平均数目为6,联合黑树莓花青素给药治疗组小鼠肿瘤平均数目仅为5。2.2 Western Blot实验检测AKT,p-AKT,HIF-1α、EZH2及H3K27me等分子蛋白的表达变化。和单独给药组相比,联合给药各组小鼠肠上皮细胞中EZH2、H3K27me及p-AKT、HIF-1α蛋白表达水平明显下调,抑癌因子PTEN的蛋白水平上调显著。本研究通过考察黑树莓花青素联合上述一线化疗药物后,对体外细胞生长及原发性结直肠癌小鼠模型肿瘤多样性的影响,发现黑树莓花青素能够协同增强上述一线化疗药物的抗肿瘤活性。机制研究揭示上述作用可能与影响AKT,p-AKT,HIF-1α、EZH2及H3K27me等分子蛋白的表达水平相关。综上所述,本研究结果提示,黑树莓花青素联合化疗药物后对提高化疗药物的功效具有重要的作用。