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养殖病害频发、种质退化严重被认为是目前影响我国对虾养殖业可持续发展的瓶颈，要成功解决这些问题，其中关键环节之一就是加强对虾基础性研究，揭示对虾自身免疫防御机制，寻找对虾病害防控、良种选育等的有效方法。有趣的是，近年来包括本课题组在内的国内外研究表明，对虾血蓝蛋白（hemocyanin，Hc）不仅具有抗病毒、抑菌等多种免疫学活性，而且还可以产生多种功能性降解肽段。然而迄今为止，与对虾抵御重要病原——白斑综合症病毒（whitespotsyndromevirus，WSSV）有关的血蓝蛋白降解肽段国内外尚未报道。为此，本研究拟在此基础之上，采用蛋白质组学、分子生物学、分子免疫学等策略对其进行深入探索，所获主要研究结果如下：
1、与对虾抵抗WSSV有关的血蓝蛋白降解肽段的鉴定
首先，采用2-DE技术从感染WSSV2h后的凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血浆中鉴定到15个表达下调、5个表达上调的差异蛋白质点。Q-TOF-MS/MS进一步分析显示，20个差异蛋白中17个蛋白被鉴定为血蓝蛋白降解肽段，其中，2个（48、49）、3个（52、54和55）上调蛋白点分别与对虾血蓝蛋白大亚基、小亚基具有高度同源性，依次将其命名为LvHcL48、LvHcL49、LvHcS52、LvHcS54和LvHcS55。
继而，采用EdmanN端测序、C端测序、全序列测序以及分子量测定等策略，对上述5个表达上调血蓝蛋白降解肽段进行进一步分析，结果成功获得2个肽段的氨基酸序列结构信息。其中，LvHcL48分子量为8927.83Da，全长79个氨基酸，与凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基C末端第584-662个氨基酸100%匹配；LvHcS52分子量为5824.09Da，全长55个氨基酸，与凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基C末端第526-580个氨基酸100%匹配。
由此说明，WSSV刺激对虾后，血蓝蛋白可以发生明显的响应，并可产生多个可能与抗性有关的降解肽段。
2.血蓝蛋白降解肽段抗WSSV活性及其作用机制的研究
2.1LvHcS52抗WSSV活性及其作用机制的研究
首先，采用基因克隆技术，在获得LvHcS52cDNA序列（165bp）的基础之上，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-LvHcS52，通过原核表达、GlutathioneSepharose4B纯化和PrecisionProtease酶切等策略，获得分子量约为6kDa的LvHcS52重组表达蛋白rLvHcS52。同时，采用固相合成法合成LvHcS52化学合成肽段sLvHcS52。
继而，在体内、外2个水平对LvHcS52抗WSSV活性进行分析。在体外细胞水平，以“LALH2O+WSSV”和“sGFP+WSSV”为对照，采用qPCR分析“sLvHcS52+WSSV”处理对虾原代血细胞不同时间后对WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421表达变化的影响。结果发现，与对照组相比，实验组处理血细胞2h、12h后，wsv069表达水平先极显著性上升（P<0.01）后显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）；wsv421表达水平在实验组处理血细胞6h、12h后均极显著性下降（P<0.01）。在体内动物水平，以“PBS+WSSV”和“rGST+WSSV”为对照，采用qPCR分析“rLvHcS52+WSSV”注射对虾不同时间后对wsv069和wsv421表达变化以及WSSV拷贝数的影响。结果显示，与对照组相比，实验组wsv069和wsv421的表达变化趋势与体外水平完全一致。同时，与对照组相比，“rLvHcS52+WSSV”注射对虾12h、24h后，对虾血细胞中的WSSV拷贝数显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。由此说明，LvHcS52在早期可能促进WSSV基因的表达，但在晚期却可以明显抑制WSSV的增殖。
最后，采用BiotinPull-down、质谱、基因克隆与原核表达、Westernblot等技术探讨LvHcS52抵抗WSSV的作用机制。结果发现，Biotin-LvHcS52不仅可与对虾血细胞膜上的β-Integrin及其胞外段原核表达蛋白GST-LvInB-ER相互作用，而且还可能可以与WSSV包膜蛋白WSV267相结合。同时，与对照组相比，LvHcS52体外处理对虾原代血细胞后，STAT信号通路关键基因和下游抗菌肽基因可发生明显的响应，其中，STAT基因在LvHcS52处理虾血细胞2-12h后表达水平显著性或极显著性表达上升（P<0.05或0.01）；ALF1、ALF3在LvHcS52处理虾血细胞2-6h后表达水平极显著下降（P<0.01），但处理12h后表达水平却显著性或极显著性上升（P<0.05或0.01）；同时STAT磷酸化水平在2–4h后明显升高。由此提示，LvHcS52抵抗WSSV的作用机制可能为：LvHcS52在WSSV感染对虾早期可能被WSSV包膜蛋白WSV267“挟持”，并通过与对虾β-Integrin相结合促进WSSV的吞噬，但在WSSV感染对虾晚期可通过激活细胞内STAT等信号通路，产生抗WSSV因子而抑制WSSV在对虾体内的增殖。
2.2LvHcL48抗WSSV活性及其作用机制的研究
首先，采用基因克隆技术，在获得LvHcL48cDNA序列（237bp）的基础之上，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-LvHcL48，通过原核表达、GlutathioneSepharose4B纯化和PrecisionProtease酶切等策略，获得分子量约为9kDa的LvHcL48重组表达蛋白rLvHcL48。
继而，在体内、外2个水平，以“PBS+WSSV”和“rGST+WSSV”为对照，采用qPCR分析“rLvHcL48+WSSV”处理对虾原代血细胞或注射对虾体内不同时间后，对wsv069和wsv421表达变化以及对虾体内WSSV拷贝数的影响。结果发现，与对照组相比，实验组wsv069和wsv421分别在处理血细胞或注射对虾2-12h和12-24h后表达水平显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。同时，与对照组相比，“rLvHcL48+WSSV”注射对虾12h、24h后，对虾血细胞中的WSSV拷贝数显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。由此表明，与LvHcS52相似，LvHcL48在体内、外2个水平均同样具有明显的抗WSSV活性。
最后，采用GSTPull-down、Far-Westernblot、质谱、基因克隆、原核表达、Westernblot等技术探讨LvHcL48抵御WSSV的作用机制。结果发现，GST-LvHcL48可与WSSV外膜蛋白VP28及其原核表达蛋白rHis-VP28发生明显的相互作用。提示，LvHcL48可能通过结合WSSV外膜蛋白VP28而延缓WSSV对细胞的侵染，最终抑制WSSV在对虾体内的增殖。
综上所述，本研究首次从对虾中发现与抵御WSSV有关的2种血蓝蛋白新的功能性降解肽段LvHcL48和LvHcS52，其抗性机制可能与激活对虾抗病毒信号通路或直接与WSSV相结合延缓WSSV侵染细胞有关。所获研究结果对深入阐明血蓝蛋白功能性降解肽段的形成机制及其在对虾免疫防御中的作用具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。
1、与对虾抵抗WSSV有关的血蓝蛋白降解肽段的鉴定
首先，采用2-DE技术从感染WSSV2h后的凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血浆中鉴定到15个表达下调、5个表达上调的差异蛋白质点。Q-TOF-MS/MS进一步分析显示，20个差异蛋白中17个蛋白被鉴定为血蓝蛋白降解肽段，其中，2个（48、49）、3个（52、54和55）上调蛋白点分别与对虾血蓝蛋白大亚基、小亚基具有高度同源性，依次将其命名为LvHcL48、LvHcL49、LvHcS52、LvHcS54和LvHcS55。
继而，采用EdmanN端测序、C端测序、全序列测序以及分子量测定等策略，对上述5个表达上调血蓝蛋白降解肽段进行进一步分析，结果成功获得2个肽段的氨基酸序列结构信息。其中，LvHcL48分子量为8927.83Da，全长79个氨基酸，与凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基C末端第584-662个氨基酸100%匹配；LvHcS52分子量为5824.09Da，全长55个氨基酸，与凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基C末端第526-580个氨基酸100%匹配。
由此说明，WSSV刺激对虾后，血蓝蛋白可以发生明显的响应，并可产生多个可能与抗性有关的降解肽段。
2.血蓝蛋白降解肽段抗WSSV活性及其作用机制的研究
2.1LvHcS52抗WSSV活性及其作用机制的研究
首先，采用基因克隆技术，在获得LvHcS52cDNA序列（165bp）的基础之上，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-LvHcS52，通过原核表达、GlutathioneSepharose4B纯化和PrecisionProtease酶切等策略，获得分子量约为6kDa的LvHcS52重组表达蛋白rLvHcS52。同时，采用固相合成法合成LvHcS52化学合成肽段sLvHcS52。
继而，在体内、外2个水平对LvHcS52抗WSSV活性进行分析。在体外细胞水平，以“LALH2O+WSSV”和“sGFP+WSSV”为对照，采用qPCR分析“sLvHcS52+WSSV”处理对虾原代血细胞不同时间后对WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421表达变化的影响。结果发现，与对照组相比，实验组处理血细胞2h、12h后，wsv069表达水平先极显著性上升（P<0.01）后显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）；wsv421表达水平在实验组处理血细胞6h、12h后均极显著性下降（P<0.01）。在体内动物水平，以“PBS+WSSV”和“rGST+WSSV”为对照，采用qPCR分析“rLvHcS52+WSSV”注射对虾不同时间后对wsv069和wsv421表达变化以及WSSV拷贝数的影响。结果显示，与对照组相比，实验组wsv069和wsv421的表达变化趋势与体外水平完全一致。同时，与对照组相比，“rLvHcS52+WSSV”注射对虾12h、24h后，对虾血细胞中的WSSV拷贝数显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。由此说明，LvHcS52在早期可能促进WSSV基因的表达，但在晚期却可以明显抑制WSSV的增殖。
最后，采用BiotinPull-down、质谱、基因克隆与原核表达、Westernblot等技术探讨LvHcS52抵抗WSSV的作用机制。结果发现，Biotin-LvHcS52不仅可与对虾血细胞膜上的β-Integrin及其胞外段原核表达蛋白GST-LvInB-ER相互作用，而且还可能可以与WSSV包膜蛋白WSV267相结合。同时，与对照组相比，LvHcS52体外处理对虾原代血细胞后，STAT信号通路关键基因和下游抗菌肽基因可发生明显的响应，其中，STAT基因在LvHcS52处理虾血细胞2-12h后表达水平显著性或极显著性表达上升（P<0.05或0.01）；ALF1、ALF3在LvHcS52处理虾血细胞2-6h后表达水平极显著下降（P<0.01），但处理12h后表达水平却显著性或极显著性上升（P<0.05或0.01）；同时STAT磷酸化水平在2–4h后明显升高。由此提示，LvHcS52抵抗WSSV的作用机制可能为：LvHcS52在WSSV感染对虾早期可能被WSSV包膜蛋白WSV267“挟持”，并通过与对虾β-Integrin相结合促进WSSV的吞噬，但在WSSV感染对虾晚期可通过激活细胞内STAT等信号通路，产生抗WSSV因子而抑制WSSV在对虾体内的增殖。
2.2LvHcL48抗WSSV活性及其作用机制的研究
首先，采用基因克隆技术，在获得LvHcL48cDNA序列（237bp）的基础之上，构建重组表达质粒pGEX-6P-1-LvHcL48，通过原核表达、GlutathioneSepharose4B纯化和PrecisionProtease酶切等策略，获得分子量约为9kDa的LvHcL48重组表达蛋白rLvHcL48。
继而，在体内、外2个水平，以“PBS+WSSV”和“rGST+WSSV”为对照，采用qPCR分析“rLvHcL48+WSSV”处理对虾原代血细胞或注射对虾体内不同时间后，对wsv069和wsv421表达变化以及对虾体内WSSV拷贝数的影响。结果发现，与对照组相比，实验组wsv069和wsv421分别在处理血细胞或注射对虾2-12h和12-24h后表达水平显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。同时，与对照组相比，“rLvHcL48+WSSV”注射对虾12h、24h后，对虾血细胞中的WSSV拷贝数显著性或极显著性下降（P<0.05或0.01）。由此表明，与LvHcS52相似，LvHcL48在体内、外2个水平均同样具有明显的抗WSSV活性。
最后，采用GSTPull-down、Far-Westernblot、质谱、基因克隆、原核表达、Westernblot等技术探讨LvHcL48抵御WSSV的作用机制。结果发现，GST-LvHcL48可与WSSV外膜蛋白VP28及其原核表达蛋白rHis-VP28发生明显的相互作用。提示，LvHcL48可能通过结合WSSV外膜蛋白VP28而延缓WSSV对细胞的侵染，最终抑制WSSV在对虾体内的增殖。
综上所述，本研究首次从对虾中发现与抵御WSSV有关的2种血蓝蛋白新的功能性降解肽段LvHcL48和LvHcS52，其抗性机制可能与激活对虾抗病毒信号通路或直接与WSSV相结合延缓WSSV侵染细胞有关。所获研究结果对深入阐明血蓝蛋白功能性降解肽段的形成机制及其在对虾免疫防御中的作用具有重要的理论意义和潜在的应用价值，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。