灵芝漆酶的性质、应用及其基因在毕赤酵母中的表达

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漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,其作用底物广泛且对环境无害,有着巨大应用潜力,但其大规模应用收到酶的经济性和效率的制约,性质优良的漆酶菌株的筛选和构建具有重要的价值和意义。论文以产漆酶菌株SYBC L48为研究对象,对其进行了分子鉴定,研究了其发酵产漆酶培养基组成、漆酶的分离纯化和酶学性质、漆酶在合成染料脱色中的应用,并对其漆酶基因进行了克隆和外源表达,主要结果如下:(1)对实验室保藏的一株产漆酶真菌进行了分子生物学鉴定,确定菌株SYBC L48属于灵芝属(Ganoderma)真菌,命名为Ganoderma sp.SYBC L48。优化后的产酶培养基为:蔗糖12 g·L-1、豆粕6 g·L-1、CuSO4·5H2O 0.5 mmol·L-1、KCl 0.5 g·L-1、KH2PO4 1g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1,MnSO4·H2O 0.01 g·L-1。在优化后的培养基下,Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶活最高达2598 U·L-1,比优化前提高了35.1%。(2)经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF离子交换层析两步纯化后得到了电泳纯的Ganoderma sp.SYBC L48漆酶蛋白,纯化倍数为13.2倍,回收率21.5%,分子量约为60kDa。纯化后漆酶的最适反应温度为60℃,温度稳定性较好,2060℃保温1 h能保持80%以上的酶活力;最适pH为2.5,在pH 5.09.0范围内,25℃保温24 h仍能保持80%以上的酶活力;Co2+、Cr3+、Fe3+对酶活力有抑制作用。以ABTS(2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))为底物时,Km值为0.044 mmol·L-1。(3)纯化后的漆酶酶液对活性亮蓝、酸性红1和孔雀石绿这3种染料的脱色效果明显,反应120 min后脱色率可分别达到76.6%、90.3%和58.1%。使用小麦种子和小球藻对染料及其漆酶降解产物的毒性进行了分析,结果表明酶处理后染料的毒性减弱。(4)扩增得到了Ganoderma sp.SYBC L48漆酶全长结构基因lac1和相应的全长cDNA序列。生物信息学分析表明lac1漆酶基因共编码525个氨基酸,其中前22个氨基酸被预测为信号肽序列,其编码的蛋白预测分子量为57.2 kDa(不包括糖基化),等电点为5.23。随后成功实现了lac1基因在毕赤酵母中的异源表达。
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