研究背景：肝小静脉闭塞病(hepatic veno-occlusive disease, HVOD)又称肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS),晦床表现为肝大、腹水、体重增加和黄疸。常因骨髓移植前大剂量使用细胞毒药物和免疫抑制剂预处理如环磷酰胺、白消胺等和／或全身放疗及服用含吡咯烷生物碱药物引起。肝移植、肺移植术后亦可发生HVOD。HVOD是骨髓移植后(HSCT)的三大并发症之一，发生率达10%-50%,重度死亡率达90%以上。预防和治疗HVOD是移植患者预后良好的关键。我国栽种土三七面广,土三七服用人群多。近年来国内因服土三七预防老年心血管疾患致肝小静脉闭塞病的报道明显增多。目前HOVD发生机制尚不明确,建立HVOD模型是研究其发生机制的关键,国内外实验室已投入大量人力物力进行研究。迄今为止关于HVOD模型已有多种,但各有利弊。Borowska等以亚硝酸胺建立HVOD模型,但病变程度一般较轻,较适合轻、中度HVOD研究。Deleve等及陈妙妍等利用大剂量野百合碱对大鼠进行灌胃,建立急性HVOD模型,成模率较高,但个体差异大,病变程度不一,造模周期短,预防用药疗效观察时间短,远期疗效不确切。国内有学者利用土三七生物碱提取成分建立HVOD模型,成模率低,并且未对该模型进行评价。目前对HVOD治疗措施有限,各种药物的疗效存在很大争议。实验室已经发现一些药物(如tPA、低分子肝素、前列腺素E1、激素、N-乙酰半胱氨酸、去纤苷等)在预防和治疗HVOD有一定作用,但其确切疗效仍存在争议。在国际上有关HVOD药物的研发领域中,目前主要是针对HVOD预防药物的研究。例如,熊去氧胆酸(优思弗)对早期HVOD有效,对中晚期患者疗效欠佳,用药途径主要是口服用药,对于伴有恶心、呕吐或口腔疾病的大部分中晚期患者限制了药物的应用。强的松、低分子肝素等对早期HVOD有一定作用,但副作用大,易出现大出血等严重并发症,临床应用需十分慎重。去纤苷是目前国际上认为治疗HVOD较有效的药物,但国内应用较少。丹参是一种改善循环的药物,其作用表现在改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤；研究发现丹参作用还表现在对肝细胞的损伤、肝纤维化、肝硬变、肝癌的治疗及调节免疫应答、抗感染和抗肿瘤等方面。丹参中的丹参素对血小板、白细胞和血管内皮细胞表达的各种细胞黏附分子具有抑制作用和抗血栓形成的作用。临床治疗中发现丹参对预防移植术后HVOD有效,丹参对土三七诱导的HVOD是否有预防作用?丹参通过什么途径对HVOD起作用?是本课题旨在研究的重要问题。本实验通过环磷酰胺、野百合碱作为模型对照,并与云南三七比较,利用土三七建立HVOD模型,并对该模型进行：①小鼠一般情况观察；②肝功能损害检测；③病理学评分。同时,本实验利用不同剂量的丹参对土三七模型进行干预,研究血管粘附分子相关改变,初步探讨丹参对HVOD防治效果及其防治作用机制。目的：建立土三七诱导的肝小静脉闭塞病模型。利用磷酸缓冲液、云南三七作为正常对照组,用环磷酰胺、野百合碱、土三七三种药物诱导肝小静脉闭塞病(HVOD)模型,比较各模型的利弊,为HVOD的研究提供良好的造模方法。方法：将110只雌性昆明小鼠随机分为五组,分别予磷酸缓冲液(PBS)、云南三七、环磷酰胺、野百合碱(MCT)、土三七灌胃,并分别在灌胃后30天、30天、30天、7天、30天处死小鼠,测肝重／体重、ALT、AST、ALB、TBIL;对肝组织进行HE染色、Masson染色,并用修改后Deleve评分标准进行病理学评分。结果：1.PBS组和云南三七组无小鼠成模,环磷酰胺组、野百合碱组、土三七组分别有5只、18只、24只成模。2.各模型组与PBS对照组比较,小鼠肝重／体重、血清ALT、AST、TBIL明显升高,ALB明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；各模型组间肝重／体重、肝功能无显著差异(P>0.05)。3.根据修改后Deleve评分标准,各模型组病理学改变符合HVOD,模型组评分土三七组、环磷酰胺组成模小鼠大部分表现为中、重度HVOD,野百合碱组成模小鼠大部分表现为轻、中度。结论：环磷酰胺、土三七、野百合碱均能诱导HVOD模型,土三七和野百合碱组成模率较环磷酰胺高。土三七诱导的HVOD模型符合人类HVOD病理改变,为HVOD进一步研究提供了新的造模方法。目的：观察丹参对土三七诱导小鼠HVOD的预防治疗作用。方法：将100只雌性昆明小鼠随机分为四组,分别为磷酸缓冲液(PBS)组、土三七组、丹参预防治疗组(分两个剂量组：100mg/kg, 200mg/kg)。各组分别连续灌胃30天,灌胃结束后处死小鼠,留取血清、肝组织。测肝重／体重、ALT、AST、ALB、TBIL;对肝组织进行HE染色、Masson染色,并用修改后Deleve评分标准进行病理学评分。用免疫组化法和RT-PCR法检测肝组织PAI-1和VEGF表达水平结果：1.土三七组、丹参100mg/kg预防治疗组、丹参200mg/kg预防治疗组分别有24只、8只、3只小鼠发生HVOD。2.丹参预防治疗组与土三七模型组比较,小鼠肝重／体重、小鼠血清ALT、AST、TBIL明显降低,ALB明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；丹参200mg/kg预防治疗组与丹参100mg/kg预防治疗组比较效果好,丹参200mg/kg预防治疗组小鼠肝重／体重明显减小,小鼠血清ALT、AST、TBIL明显降低,血清ALB明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.各组小鼠肝脏病理评分结果：土三七组发生HVOD小鼠肝脏病理评分大部分表现以中、重度为主；丹参100mg/kg预防治疗组HVOD小鼠多表现为轻、中度,仅1例为重度；丹参200mg/kg预防治疗组发生HVOD小鼠多为轻度,无一例表现为重度。4.肝组织PAI-1及VEGF免疫组化结果：丹参预防治疗组与土三七模型组比较,PAI-1和VEGF水平显著降低(P<0.05),丹参200mg/kg预防治疗组PAI-1与VEGF水平比丹参100mg/kg预防治疗组下降更明显(P<0.05)。5.肝组织RT-PCR检测PAI-1及VEGF的mRNA结果：丹参预防治疗组与土三七模型组比较,PAI-1和VEGF mRNA水平显著降低(P<0.05),丹参200mg/kg预防治疗组PAI-1和VEGF mRNA水平比丹参100mg/kg预防治疗组显著降低(P<0.05)。结论：1.丹参预防治疗土三七诱导HVOD有效小鼠的血清ALT、AST、TBIL下降、ALB增加,减轻肝窦内皮细胞和肝细胞病理损害,从而降低肝组织病理学评分。2.不同剂量丹参可减少土三七诱导小鼠HVOD的发生。丹参组肝脏PAI-1和VEGF水平明显降低,HVOD发生率低,丹参200mg/kg组较丹参100mg/kg组预防治疗效果显著。丹参组小鼠肝脏PAI-1和VEGF水平降低,病情程度相对较轻,提示HVOD小鼠预后较好,肝脏PAI-1和VEGF表达水平检测可作为HVOD病情程度及预后监测指标。目的：观察丹参对土三七诱导HVOD小鼠肝脏肿瘤坏死因子a、血管内皮生长因子、血管细胞间粘附分子1、细胞间粘附分子1、核转录因子p65 mRNA和蛋白水平及血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2的mRNA水平,探讨丹参预防HVOD的作用机制。方法：(1)每组随机取4只小鼠肝脏行RT-PCR检测：肿瘤坏死因子a、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、血管细胞间粘附分子1、细胞间粘附分子1、核转录因子mRNA表达。(2)每组随机取5只小鼠肝脏行western bloting检测肝组织肿瘤坏死因子a、血管内皮生长因子、血管细胞间粘附分子l、细胞间粘附分子1、核转录因子p65的蛋白水平。结果：1.肝组织RT-PCR检测的mRNA结果：肿瘤坏死因子a、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、血管细胞间粘附分子1、细胞间粘附分子1、核转录因子p65 mRNA表达模型组比PBS组显著升高(P<0.05)；丹参预防治疗组比模型组显著降低(P<0.05)。2.肝组织western bloting检测蛋白结果：肝组织肿瘤坏死因子a、血管内皮生长因子、血管细胞间粘附分子1、细胞间粘附分子1、核转录因子p65蛋白表达模型组比PBS组显著升高(P<0.05)；丹参预防治疗组比模型组显著降低(P<0.05)。结论：1.丹参可能通过下调肝组织中VCAM-1、ICAM-1、NF-κBp65 mRNA和蛋白表达,抑制炎性因子的表达,减少渗出,抑制血栓形成,减少HVOD发生。2.丹参可能通过下调肝组织中VEGF mRNA和蛋白表达及VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA的表达,阻止肝窦内皮细胞的迁移,减少内皮通透性,从而减少HVOD发生。丹参是一种活血化瘀的中成药,已有报道丹参对预防心脑血管血栓形成具有重要作用。临床发现丹参对移植术后HVOD发生具有显著效果。丹参对土三七诱导的HVOD有无作用?通过什么途径起作用是本课题研究需解决的重要问题。本研究首次运用土三七煎液灌胃诱导小鼠HVOD模型,并对该模型进行病理学评分。用丹参预防治疗土三七诱导的小鼠HVOD模型来观察丹参预防性治疗HVOD的效果,并初步探讨丹参预防治疗HVOD发生的作用机制。本研究采用血清生化学,病理学的HE染色、Masson染色、免疫组织化学染色,RT-PCR、Western bloting等方法,从血清生化、组织、mRNA、蛋白的水平来评价丹参预防性治疗HVOD的效果和探讨丹参预防HVOD发生的作用机制。结果：①土三七能诱导小鼠HVOD发生,成模率高,病理学改变符合人类HVOD变化。②丹参具有降低小鼠血清ALT、AST、TBIL,增加ALB,减少肝窦淤血,减轻肝窦内皮细胞和肝细胞变性、坏死的作用。③丹参具有降低小鼠肝脏PAI-1、VEGF mRNA和蛋白表达作用,PAI-1、VEGF可作为评价HVOD预后标志之一。④丹参具有下调小鼠肝组织中TNF-a、VCAM-1、ICAM-1、NF-κBp65 mRNA和蛋白表达,抑制炎性因子的表达,防止血栓形成,减少HVOD发生的作用。⑤丹参具有下调肝组织VEGF mRNA和蛋白表达及VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA的表达的作用。结论：土三七能成功诱导小鼠HVOD发生。丹参对土三七诱导的小鼠HVOD有预防性治疗作用。其作用机制可能与减少炎症因子,降低肝组织VCAM-1、ICAM-1、NF-κBP65 mRNA和蛋白表达,预防血栓形成有关。丹参可降低VEGF mRNA和蛋白表达及VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA的表达,从而阻止肝窦内皮细胞的迁移、坏死,减少内皮细胞间通透性,预防肝窦淤血。本课题研究结果为丹参临床治疗HVOD提供实验依据。