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目的:①构建具有单核细胞分化特点的人U937细胞定向克隆cDNA表达文库;②采用急性单核细胞白血病患者的混合血清对U937细胞cDNA表达文库进行免疫筛选,以得到可引起免疫应答的白血病肿瘤相关抗原;③通过生物信息学分析,比较筛选得到的阳性克隆,获取具有应用价值的独立知识产权的新基因,为该课题的进一步研究确定方向.方法:①提取U937细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoR Ⅰ适配子,磷酸化EcoR Ⅰ适配子5端;Xho Ⅰ酶切后,Sephacryl-S400柱除去小于400bp cDNA片段,与入ZAP表达载体连接,包装蛋白包装后建成cDNA文库;倍比稀释后感染大肠杆菌XL1-Blue-MRF,测定文库大小及重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;提取质粒,经EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶切后,初步确定片段的大小及多样性.②感染有重组入ZAP噬菌体的大肠杆菌XL1-BlueMRF铺于150mm NZY平板,37℃倒置培养6h后,将IPTG预先处理的硝酸纤维素膜覆盖于平板上,继续培养10h,做好标记;取下硝酸纤维素膜,用封闭液室温封闭1h后,置于1:100稀释的白血病患者血清(预先用大肠杆菌裂解物吸收)中孵育15h,再置于1:2500稀释的生物素化二抗中孵育1 h,然后与1:2500稀释的碱性磷酸酶标记的亲合素孵育1h;采用NBT/BCIP对阳性噬斑显色;挑取阳性噬菌斑,再经3轮复筛,直至得到一致的阳性噬斑.③获得的阳性噬菌体克隆,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,在大肠杆菌XL1-Blue MRF中剪切后,转变为PBK-CMV噬菌粒,感染大肠杆菌XLOLR后,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶切后,初步确定片段的大小,然后测序.④采用BLAST软件进行序列同源性分析;采用Grail、ProtParam、ScanProsite、SOPMA、TMpred、SignalP、Psort、HLA_Bind等软件分析阳性克隆的编码区、功能位点、二级结构、特殊结构、细胞定位及抗原决定簇情况等,为进一步的功能研究奠定基础.