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NAD+依赖的氧化还原酶具有高催化活性、区域选择性和立体选择性,是制药工业、精细和专用化学品领域生产手性化合物的研究及开发热点。基于序列和结构信息的理性设计以及定向进化,已成为酶工程领域的核心技术。学位论文围绕酶催化循环过程描述:底物迁移和识别、催化反应和产物释放,开展理性设计苹果酸酶、丙氨酸脱氢酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶的研究工作,结果如下:（1）以苹果酸酶（EC 1.1.1.40）为对象,在原子水平上动态描述酶的催化循环,揭示了苹果酸酶立体选择性底物识别的结构基础。L-苹果酸是苹果酸酶的天然底物,具有较高的结合能,D-苹果酸作为抑制剂具有较低的结合能。D-苹果酸与Arg165形成共面离子反应,与Mn2+的配位角接近90°。与L-苹果酸相比,这种结合构象导致D-苹果酸具有更高的亲和力和更高的势垒。催化阶段,β-脱羧步骤是限速步骤,有效活化能垒为16.44 kcal/mol,比氢化物转移步骤高约4.58 kcal/mol,该结果与通过实验kcat值推导的一致。产物释放阶段,Leu167和Asn421组成一个“摆动门”。L/D-苹果酸从结合口袋逃逸需要克服的能垒比丙酮酸高约5.8 kcal/mol,在合成L-苹果酸的方向上需要更开放的构象。（2）以丙氨酸脱氢酶（EC 1.4.1.1）为对象,使用QM/MM方法在PM6水平上研究脱氢酶的催化机理,提高丙氨酸脱氢酶胺化反应活性,用于丙氨酸合成。当His96作为广义酸/碱时,氢化物转移步骤势垒为39.71 kcal/mol,水亲核攻击步骤势垒约为8 kcal/mol。因此,氢化物转移步骤是限速步骤,His96是催化酸/碱残基,而不是Lys75。当Tyr94突变为Phe94时,QM/MM-US、ONIOM和QM/MM-SMD三种方法,分别在PM6、B3LYP/6-31G*和B3LYP/6-31G*理论水平计算得到脱氨反应活化能垒增加2.33 kcal/mol、0.9 kcal/mol 和 1.67 kcal/mol,胺化反应活化能垒降低 3.29 kcal/mol、1.0 kcal/mol和1.18 kcal/mol,即脱氨反应kcat值降低,胺化反应kcat值增加。MM/PBSA结合相互作用熵方法计算结合自由能,结果显示脱氨反应方向结合自由能降低了 3.4 kcal/mol,Km值会降低;胺化反应方向结合自由能增加了 0.89 kcal/mol,Km值可能会略有增加。重组表达Tyr94Phe突变体,酶动力学参数分析表明脱氨反应kceat值降低了 56%,胺化反应kcat值增加了 30%,去稳基态导致胺化反应Km值增加了 30%。（3）以meso-2,3-丁二醇脱氢酶（EC 1.1.1.B20）为对象,通过分子动力学模拟鉴定了酶的底物通道,底物结合结构域α4-螺旋和两个短α螺旋向外摆动暴露配体的疏水结合腔,从而使产物和辅因子从活性口袋中释放。进一步的MM/GBSA结合自由能分析表明,Phe212和Asn146是关键的产物释放位点。针对这两个位点的定点重组表达及酶学性质分析表明,Asn146Gln突变体保留了野生型酶活性,但Asn146Ala突变则完全丢失了活性;而Phe212Tyr的kcat值增强至野生型的3-7倍,催化效率增强至野生型2-4倍。（4）使用反应性构象数、MM/PBSA-相互作用熵和热动态积分方法评估meso-2,3-丁二醇脱氢酶的底物结合自由能,使用ONIOM和QM/MM-SMD在B3LYP/6-31G*理论水平上评估活化能垒。结果表明,决定meso-2,3-丁二醇脱氢酶立体选择性的主要因素是底物结合,即天然底物R-乙偶姻的结合自由能低于S-乙偶姻;决定（2S,3S）-2,3-丁二醇脱氢酶立体选择性的主要因素是催化过程,即还原天然底物S-乙偶姻的能垒比还原R-乙偶姻的能垒低2.52 kcal/mol。2,3-丁二醇脱氢酶催化还原丁二酮形成乙偶姻是不可逆的反应,分子动力学模拟揭示乙偶姻不能稳定地结合在活性口袋中是其不可逆的主要原因。使用分子动力学模拟结合反应性构象的数量虚拟筛选发现Trp190Met突变体具有预期的活性,定点突变的重组蛋白,酶活性分析证明Trp190Met具有乙偶姻氧化活性。基于Trp190Met突变位点,发现了来自乳酸乳球菌的2,3-丁二醇脱氢酶（Ll-BDH）,具有氧化乙偶姻形成丁二酮的活性,重组Ll-BDH酶动力学的Km为283.70mM,kcat为0.49 s-1,证明2,3-丁二醇脱氢酶催化还原丁二酮形成乙偶姻是可逆的。Ll-BDH是首次报道的氧化乙偶姻形成丁二酮的酶。综上,基于模拟酶催化循环的全程,在原子水平上揭示酶催化机制,扩展酶的结构和功能知识,阐明了苹果酸酶和2,3-丁二醇脱氢酶的立体选择性机制;通过去稳基态,提高了丙氨酸脱氢酶的胺化反应的kcat值;通过改造产物释放通道提高了 2,3-丁二醇脱氢酶的催化效率,并且基于底物结合增加形成反应性构象的概率,首次设计和报道了具有氧化乙偶姻形成丁二酮活性的酶。基于酶催化循环的NAD+依赖性氧化还原酶理性设计技术,结合高通量实验、先进的分子生物学技术和机器学习,可快速获得具有多种天然甚至非天然催化活性的酶,充分利用低成本和更具可持续性的生物催化,推动生物催化的产业化发展。