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乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了3.5亿，占全球人数的5％。HBV感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和／或噬菌体整合酶系统，建立HBV急性感染小鼠模型和HBV小鼠体内长期表达模型，用于HBV致病机制研究以及抗HBV药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下：1．真核表达质粒的构建与鉴定以真核表达载体pCI-neo为构架，将1.3倍长HBV全基因组连接在不同真核表达载体中，构建HBV全基因组重组质粒pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3和pCI-neo-CMV-HBV1.3。2．急性HBV感染小鼠模型的建立水动力转染方法将HBV表达质粒转染Balb／c小鼠（免疫系统正常小鼠）和Balb／c裸鼠（免疫系统缺陷小鼠）体内，观察HBV在小鼠体内复制和表达情况。结果表明，HBV在小鼠体内转录出相应病毒mRNA。通过免疫组织化学和血清ELISA方法，分析HBV在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第3天Balb／c小鼠血清中HBsAg检出率为100％，但HBsAg的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为7天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb／c裸鼠血清中HBsAg持续阳性约为30天。采用血清real-time PCR的方法，分析了急性感染小鼠体内HBV的复制和分泌特征。小鼠血清中存在HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准（≥103copies／ml），在第3天最高可达到107copies／ml。Balb／c小鼠体内HBV DNA在30天后降至阳性临界值以下，Balb／c裸鼠可以维持45天左右。血清中HBV DNA的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是HBV感染Balb／c小鼠还是Balb／c裸鼠，HBV在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长HBV在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达HBV小鼠模型的设想。3．HBV小鼠体内长期表达模型的建立噬菌体φC31整合酶能识别噬菌体的attP位点和宿主基因组上的attB位点，由于attP位点和attB位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的attP同源序列mpsL1和mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列attB位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。在已构建的含HBV1.3基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点attB，得到含整合酶识别位点attB的质粒pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3和pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒pCMV-Int共转染Balb／c小鼠肝脏，观察HBV在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。结果表明，HBV在小鼠肝脏中转录出相应病毒mRNA。转染45天后小鼠肝细胞中仍表达HBcAg病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第30天仍持续阳性。血清real-time PCR的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量（107copies／ml）明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后100天时仍然在临床规定的阳性水平之上。由于HBV在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点—mpsL1设计引物，利用巢式PCR鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了HBV在体内的中间复制模板cccDNA，证明HBV表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗HBV药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清HBV DNA在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。综上所述，本研究初步建立HBV急性感染小鼠模型和HBV小鼠体内长期表达模型，为HBV发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。