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研究背景急性白血病是一类严重危害儿童健康的肿瘤性疾病,根据增生的白细胞种类不同,分为急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)和急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia, AML)两大类。其中AML约占儿童急白血病的25-30%,除急性早幼粒细胞白血病外,余各型化疗效果、缓解率及5年无病生存率均较差。因此开发新的AML治疗方法,改善AML患儿的预后,成为儿科血.液工作者亟待解决的课题。核转录因子(nuclear factor kappa B, NF-κB)是近年发现的与细胞增殖、凋亡密切相关的一类转录因子。NF-κB家族有5个成员,彼此结合以同源或异源二聚体的形式存在于细胞质中,其中由p50和p65亚基组成的异源二聚体p50/p65是发现时间最早、分布最为广泛、主要发挥作用的一类核转录因子,可与多种启动子和/或增强子的序列特异性结合,促进转录的发生,在免疫应答、炎症反应及细胞增殖与凋亡等病理生理过程中发挥重要作用。近年研究发现,NF-κB的不适当激活与血液系统肿瘤的发生、增殖、转移及细胞耐药密切相关,对NF-κB进行调控目前已经成为抗肿瘤治疗的热点。近年,新兴的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术为进一步研究NF-κB的功能提供了技术支持。RNAi是指通过人为方式将与内源性mRNA互补的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞,引起特定mRNA的降解,编码的基因不能表达,引发相应基因沉默的技术,具有高效、特异性、细胞毒性低等特点,也是基因治疗的方法之一。急性单核细胞白血病是儿童AML中化疗缓解率、预后差的几种类型之一,主要表现为异常的原始及幼稚单核细胞的恶性增殖及凋亡受抑。本课题组前期试验证实,在儿童急性单核细胞白血病细胞株THP-1中有NF-κB的持续激活。设想可通过RNAi技术抑制NF-κB的表达,促进THP-1细胞的凋亡,在体外研究中为AML的基因治疗提供一个新的治疗靶点。研究目的本实验通过应用特异性NF-κB p65 siRNA转染THP-1细胞,观察其对THP-1细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。研究方法体外培养THP-1细胞,将处于指数生长期的细胞进行分组：①空白对照组,使用PBS液处理细胞；②阴性对照组,即NC组,应用control siRNA转染THP-1细胞；③实验组,应用NF-κB p65 siRNA转染THP-1细胞。采用半定量RT-PCR及Western Blot方法分别检测p65、CyclinD1及IκBα的基因及蛋白的表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)、AnnexinV/PI检测细胞凋亡,CCK-8测定细胞增殖。实验结果1. Control siRNA转染THP-1细胞的效率应用荧光素标记的control siRNA-FITC转染THP-1细胞,通过荧光显微镜观察转染效率,结果显示转染24小时的效率最高,达60%以上2. NF-κB p65 siRNA干扰效应的检测RT-PCR结果显示,实验组p65 mRNA表达明显减低,以48小时作用最为明显,抑制率达(75.52±4.02)%,而空白对照组及阴性对照组则无明显改变；Western Blot结果显示转染48小时,空白对照组、阴性对照组及实验组中p65蛋白相对含量依次为2.41±0.11、2.33±0.09、0.82±0.10,p65 siRNA干扰组明显减低(P<0.01),对蛋白抑制率达(74.68±5.27)%。表明NF-κB p65 siRNA可有效地干扰了p65 mRNA及蛋白的表达,于48小时干扰效应最明显。3. NF-κB p65 siRNA对CyclinD1mRNA及蛋白表达的影响RT-PCR及Western Blot结果显示,转染48小时后,实验组CyclinD1 mRNA及蛋白的表达明显减低,而空白对照组及阴性对照组则无明显改变。表明NF-κB p65 siRNA可有效抑制CyclinDl mRNA及蛋白表达。4 NF-κB p65 siRNA对IκBamRNA及蛋白表达的影响RT-PCR结果显示,干扰48小时,实验组iκBa mRNA表达增加,表达率达(1.25±0.05),而空白对照组及阴性对照组则无明显改变；Western Blot结果显示空白对照组、阴性对照组及实验组中IKBα蛋白表达依次为0.76±0.06、0.81±0.02、1.14±0.06, p65 siRNA干扰组明显升高(P<0.01)。表明NF-κB p65 siRNA作用后IκBα表达增加。5 NF-κB p65 siRNA对THP-1细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示转染48小时,实验组THP-1细胞凋亡率(8.49±0.14)%较空白组(2.77±0.46)%及阴性对照组(2.88±0.61)%显著增加(P<0.05),TUNEL方法结果显示转染48小时,实验组THP-1细胞凋亡率(16.47±1.75)%较空白组(4.30±1.47)%及阴性对照组(3.69±0.86)%%著增加(P<0.05)6 NF-κB p65 siRNA干扰对THP-1细胞增殖的影响CCK-8结果显示：与空白组及阴性对照组相比较,NF-κB p65 siRNA作用的实验组细胞增殖速度在第2天速度明显减慢,缺乏指数生长特征,而空白组及阴性对照组的细胞均呈指数增殖。表明NF-κB p65 siRNA对THP-1细胞的增殖起抑制作用。实验结论特异性NF-kB p65 siRNA可有效抑制NF-kB p65的表达,并可有效抑制THP-1细胞的增殖,并促进其凋亡,因此可能是儿童急性单核白血病基因治疗的潜在靶点之一。