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【研究背景】经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）及支架植入术应用于临床以来，术后20％～30％的再狭窄（RS）率一直制约其远期疗效，因此也成为心血管领域研究的热点和难点问题。随着细胞生物学和分子生物学的飞速进展，细胞外基质（ECM）受到广泛关注和研究。ECM如纤维粘连蛋白（FN）、胶原（Col）和层粘连蛋白（LN），通过其相应的细胞膜粘附分子整合素受体，激活细胞内多个信号转导途径，调节细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达等多方面生物行为，参与RS形成和发展。因此我们设想，通过阻断ECM－细胞－整合素受体构成的细胞与基质的粘附系统内部之间的联系，并进而阻断其受体后信号转导途径，就可达到阻断平滑肌细胞过度增殖、迁移和基质大量合成这三个关键的环节，可望成为抑制再狭窄的新策略。但是ECM中各种成分如何对平滑肌细胞进行调节，整合素受体各亚基的表达水平及介导产生怎样的效应，均不十分清楚。 【目的】本实验旨在探讨ECM中两种重要成分纤维粘连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）及其整合素受体α5β1对平滑肌细胞生物功能的调节，并进一步采用反义基因转染和物理因素恒磁场干预，观察对细胞-ECM之间相互作用及信号转导的作用，为RS治疗提出新的靶点。 【方法】对人脐动脉平滑肌细胞的原代培养方法进行改进。建立体外FN和LN可溶性和不容性两种物理状态，以模拟体内的病理情况。采用3H-TdR掺入和MTT法检测细胞增殖能力，3H-羟脯氨酸检测细胞合成胶原能力，进行细胞粘附实验、Transwell细胞迁移实验检测细胞粘附和迁移能力。流式细胞仪检测细胞周期。单标记和双标记间接免疫荧光染色检测细胞整合素α5和β1、FN及细胞骨架蛋白α-SM-Actin的表达和分布。构建整合 刃四旱区大学俗士学世公文7 素反义真核表达载体AS心和AS仙转染平滑肌细胞，或用不同磁感应强 度的恒磁场干预细胞，透射电镜检测干预后细胞超微结构变化，流式细胞 仪检测细胞周期变化，厂乍stem Blot检测细胞表达整合素蛋白和磷酸化FA K 水平，DOt BIOt检测转染前后细胞整合素tRNA水平，用 FltO－3／AM标iC 细胞内时＼ 激光扫描共聚焦显微镜枝术检测细胞内游离比”浓度变化。 【结果】 一、人动脉平滑肌细胞原代培养方法的改良 小动脉平滑肌细胞培养可以采用动脉环直接接种的方法进行培养，接 种后培养瓶翻转前时间适当延长至5－6h，可以使组织块更好贴壁以及去除 成纤维细胞的污染。加入较高浓度bFGF和EGF，使长出时间提前5－7天， 而且模拟了体内局部病理环境。加入NaHCO；无细胞毒性。鉴定平滑肌细 胞时应选取原代培养的前3代，免疫细胞化学SABC法染色及间接免疫荧 光染色证实细胞表达a－SM－Actin，分别呈黄褐色丝状及丝状红色荧光分布 于胞浆内，透射电镜可见典型的平滑肌细胞肌丝形成的密斑和密体及吞饮 小泡。 二、不同物理状态的FN和LN对细胞生物行为的影响 卜 不同物理状态的FN和LN对细胞生物行为的作用不同。用20、40、60、 80、100 pg．／mL五种浓度65 FN和 LN，友现随浓度逐渐增加，iFN组fro胞 吸光度值、‘H＊dR掺入量、细胞粘附百分数、迁移细胞数均显著增加，iLN 则轻度促进增殖和粘附，而抑制细胞迁移，并呈浓度依赖性。sFN和sLN 对 hUASMCS的增殖、粘附呈浓度依赖性抑制，而 SLN则促进细胞迁移。 二 分别力。、抗整合素。；和pl亚基的抗体PIh年NCIO、＊＊＊mP短肽、 酪氨酸激酶抑制剂Gel。istein和钙通道阻断剂Nicaxdipine千预rN和几N介 导的细胞生物行为，友现对细胞增殖和粘附的抑制强度是Genistein＞ GRGDSP短肽＞P4C一PI D6＞Nicardipine。对细胞迁移的子 制强度是 GRGDSP短肽＞P4C10＞G＞flistsifl＞PID6＞NICCdlplflfl。 3．浓度为 60～100卜u／mL的 iFN和 sLN，显著促进 hUASMCs的胶原合成 能力，iFN较 sLN作用更强。但低浓度 20、40pg／mL与对照组无明显差别。 而 SFN、iLN则抑制细胞合成胶原。 4．iFN使细胞表达整合素 15和A 增加，并使其形成微。］、簇状粘着斑，o sFN组整合素a。和p；及 Actin呈弥散分布，没有形成微小簇状粘着斑。 三、转染反义整合素l。和pl真核表达载体对平滑肌细胞生物行为的改变 l．pECE－a。和pECE｝为模板，进行修饰聚合酶链反应（mPCR），得到两 I’Is伽ie OfO汕ov地cular砌eme风WU 2002 剪曰旱巨大攀俗士学位论文 吕 端分别带有ECORI和HIOdlll酶