脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)是一类丝氨酸型水解酶，可以催化多种反应，被广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。脂肪酶存在于许多动植物及微生物中，微生物来源的脂肪酶种类多、底物谱广、pH及温度适应范围广，是工业用脂肪酶的重要来源。 酶的定向进化技术是国内外研究的热点领域，多样性突变库、高通量筛选平台和高效表达体系是酶的定向进化技术三个核心。目前对于脂肪酶定向进化的研究而言，主要的瓶颈技术在于建立高效的蛋白表达系统和高通量的筛选平台。脂肪酶在表达系统的高效、高活性可溶性表达，是真实反映脂肪酶基因突变以及保证筛选灵敏度的基础；而高通量、快速、灵敏、准确的筛选检测方法是酶定向进化获得成功的必要保证。 为了定向进化脂肪酶，本课题探讨了采用显色底物及其比色法高通量测定脂肪酶活力的可行性，并选用枯草杆菌脂肪酶A作为定向进化的对象，探索其在原核表达系统中高效、高活性可溶性表达，以解决目前脂肪酶定向进化中的瓶颈问题。 根据Genebank提供的枯草杆菌脂肪酶A的基因序列，设计两条引物pLF和pLB，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出目的基因片段。构建重组表达质粒pGEX-BL-2，并转入宿主大肠杆菌BL2l(DE3)中。 诱导基因工程菌BL21<'+>可溶性蛋白的表达，经SDS-PAGE电泳可以观察到大小在19 kDa左右的目的蛋白。优化蛋白表达的诱导条件，确定在IPTG 1.2 mmol/L，诱导3 h时可溶性目的蛋白的量达到最大。用酸碱滴定法测得重组脂肪酶活力为879 U/g，相对偏差为8．32％；在37℃pH 11.0的缓冲液中用比色法测得重组脂肪酶活力为3830 U/g，相对偏差为3.89％。 从底物稳定性、相对误差、耗时长短、反应灵敏性等方面系统地比较了显色底物比色法和酸碱滴定法。结果发现，采用比色法在96孔板上测定脂肪酶活力，操作简便，耗时短，相对偏差较小，因此初步确定比色法可用于高通量测定脂肪酶活力。 在96孔板上对20批约2000个样品进行测试，结果发现，脂肪酶活力高通量测定方法确实迅速简便，且重现性好，在优化反应体系、降低测定相对偏差之后可以作为脂肪酶活力高通量筛选的平台。 本课题初步建立了操作简便、耗时短、灵敏度高、相对偏差小、重现性好的脂肪酶活力的高通量测定方法。同时在大肠杆菌高效表达出具有活性的枯草杆菌 脂肪酶A。解决了脂肪酶定向进化的两个关键环节。