研究背景：鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在东南亚地区,尤其我国南方,如广东、广西、湖南、江西、福建等省高发。成为癌症死亡的主要原因,鼻咽癌首选放射治疗,5年生存率50%左右。调强适形放疗(intensity modulated radiotherapy IMRT)和三维适形放疗(3 dimensional conformal radiotherapy 3D-CRT)的出现,提高了肿瘤组织的放射剂量,降低了正常组织的放射剂量,使鼻咽癌5年生存率有进一步的提高。但鼻咽癌对放疗中度敏感,部分患者放疗后仍有肿瘤残留,为提高局控率增加放射剂量将增加放射并发症,严重影响患者生活质量。因此寻找放射增敏手段,减少放射并发症,提高患者生活质量,成为世界范围内放射肿瘤学研究的内容。高压氧是吸入氧分压大于一个大气压的氧气的治疗方法,由于高压氧可以增加组织氧浓度、氧分压、增大氧的弥散距离,具有减轻水肿和各种缺血缺氧性损伤,促进血管生成,激活纤维母细胞,调节机体免疫力等多种作用。因此广泛应用于组织坏死感染、创伤。已有研究表明高压氧能增强放射治疗对肿瘤乏氧细胞的杀伤作用,提高肿瘤局控率,减少肿瘤复发,降低放疗并发症。研究目的：通过体外及体内试验探索高压氧对鼻咽癌放射敏感性的影响及其作用机制,为高压氧辅助放射治疗应用于鼻咽癌的临床研究提供理论和实践依据。整个研究内容分两部分进行,第一部分是高压氧对鼻咽癌放射敏感性影响的体外研究。研究方法：鼻咽癌细胞株CNE-2经传代培养后,分为对照组、高压氧组、放射组、高压氧+放射组。(1)应用MTT检测高压氧和放射治疗对鼻咽癌CNE-2细胞增殖能力的影响；(2)应用克隆形成试验通过线性二次方程拟合细胞存活曲线,单击多靶模型计算放射生物学参数,评价高压氧治疗对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响；(3)应用FCM分析高压氧和放射治疗对鼻咽癌CNE-2细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。结果：(1)MTT观察：放射组2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy治疗后CNE-2细胞增殖抑制率分别为0.1038±0.0151、0.1533±0.0135和0.2097±0.1076,0.2227±0.0353,0.2102±0.0112；2.0ATA高压氧±2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy治疗后CNE-2细胞增殖抑制率分别为0.1532±0.0155、0.2088±0.0188、0.2538±0.0128、0.2518±0.0220、0.2485±0.0184,各组与放射各组比较均有差异(P<0.05)；2.5ATA高压氧+2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy治疗后CNE-2细胞增殖抑制率分别为0.2062±0.0124、0.2502±0.0199、0.3093±0.0187、0.3030±0.0257、0.3127±0.0228,各组与放射各组比较均具有差异(P<0.05)。2.5ATA高压氧+不同剂量放射组CNE-2细胞增殖抑制率均高于2.0ATA高压氧+不同剂量放射组,差异均具有显著性(P<0.05)。(2)克隆形成试验显示：放射组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组D0(一次照射杀死63%细胞的剂量)、SF2(照射2Gy时存活分数)分别为2.217,0.736；1.678,0.376；1.635,0.357。2.0ATA高压氧放射增敏比SER(D0)和SER(Dq)分别为1.321和6.033,2.5ATA高压氧放射增敏比SER(D0)和SER(Dq)分别为1.341和6.908。放射组4、6、8Gy CNE-2细胞存活分数分别为0.350±0.055、0.174±0.011、0.040±0.001；2.0ATA高压氧+4、6、8Gy放射组CNE-2细胞存活分数分别为0.107±0.012、0.038±0.008、0.010±0.000,各组与放射各组比较均有差异(P<0.05)；2.5ATA高压氧+4、6、8Gy放射组CNE-2细胞存活分数分别为0.101±0.069、0.027±0.000、0.008±0.000,各组与放射各组比较均有差异(P<0.05)。(3)FCM检测表明：放射组8、10Gy、2.0ATA高压氧+6Gy、8、10Gy及2.5ATA高压氧+4、6、8、10Gy组G2/M期细胞百分率均高于对照组(P<0.05)；2.0ATA高压氧组和2.5ATA高压氧组S期细胞百分率分别为25.43±1.40和27.73±1.04,均高于对照组S期细胞百分率16.40±1.41(P<0.05)；2.0ATA高压氧+8、10Gy组和2.5ATA高压氧+不同放射剂量组S期细胞百分比均高于对照组(P<0.05)。放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组、2.5ATA高压氧+放射组细胞凋亡率均大于对照组(P<0.05)。2.0ATA高压氧+不同放射剂量组及2.5ATA高压氧+不同剂量放射组细胞凋亡率均大于不同剂量放射组(P<0.05)。本研究的第二部分是高压氧对鼻咽癌放射敏感性影响的体内试验研究。研究方法：试验动物分为对照组、放射组、高压氧组、高压氧+放射组。(1)建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,绘制移植瘤生长曲线,计算各组肿瘤抑制率,评价高压氧对鼻咽癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响；(2)应用免疫组化法检测高压氧和放射治疗对鼻咽癌移植瘤组织中p53、Bcl-2、Bax、Ki67、CD31 (PECAM-1)表达的影响；(3)应用TUNEL试验评价高压氧和放射治疗对鼻咽癌裸鼠移植瘤凋亡指数(apoptotic index AI)的影响；(4)应用Western blot和RT-PCR方法检测高压氧和放射治疗对鼻咽癌移植瘤组织中p53、Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达的影响。结果：(1)放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组以及2.5ATA高压氧+放射组肿瘤抑制率(%)分别为94.39±1.40,7.09±2.23,10.91±3.38,98.00±0.26和99.34±0.28。2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组肿瘤抑制率均大于放射组(P＜0.05)。(2)免疫组化显示：对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组p53蛋白表达阳性率分别为16.67%、83.33%、83.33%、100.00%、100.00%和100.00%。各治疗组p53蛋白表达阳性率均高于对照组(P<0.05)。说明高压氧和放射可不同程度诱导p53蛋白的表达；Bcl-2免疫组化显示对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组Bcl-2蛋白表达阳性表达率分别为83.33%,100.00%,100.00%,83.33%,83.33%,100.00%。各治疗组与对照组比较均无明显差异(P>0.05)；Bax免疫组化显示对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组Bax蛋白表达阳性率分别为16.67%、100.00%、83.33%、100.00%、100.00%、100.00%。各治疗组与对照组比较均有明显差异(P<0.05)。说明高压氧和放射有促进Bax蛋白表达增高的趋势；Ki67免疫组化显示对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组Ki67蛋白表达阳性率分别为83.33%、100.00%、100.00%、83.33%、100.00%和100.00%。各组比较均无差异(P>0.05)；CD31(PECAM-1)蛋白在各组移植瘤组织中有阴性至弱阳性的表达。对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组CD31蛋白表达阳性率分别为0.00%、16.67%、0.00%、16.67%、0.00%、16.67%。各治疗组和对照组表达无明显差异(P>0.05)。(3)TUNEL试验显示对照组、放射组、2.0ATA高压氧组、2.5ATA高压氧组、2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组凋亡指数AI(%)分别为2.21±0.97,5.54士1.24,4.43±1.09,4.89±0.94,10.67±2.62和15.69±3.78。各治疗组与对照组比较均有显著差异(P＜0.05)。(4) Western blot和RT-PCR观察到p53和Bax在鼻咽癌移植瘤组织中的蛋白和mRNA水平的表达与免疫组化分析的结果相似,对照组Bcl-2在蛋白和mRNA水平的表达明显弱于高压氧组和放射组,高压氧+放射组Bcl-2蛋白和mRNA水平的表达又弱于高压氧组或放射组,提示高压氧和放射均抑制Bcl-2在移植瘤组织中的表达,且表现为协同效应。本研究最后得到以下结论：(1)体外实验显示放射治疗对鼻咽癌CNE-2细胞的增殖有明显的抑制作用。高压氧治疗对鼻咽癌CNE-2细胞有放射增敏作用。(2)高压氧治疗引起鼻咽癌CNE-2细胞阻滞于S期,放射治疗导致鼻咽癌CNE-2细胞阻滞于G2/M期,高压氧+放射治疗诱导鼻咽癌CNE-2细胞阻滞于S期和G2/M期。(3)高压氧和放射治疗均可诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡,高压氧+放射治疗对鼻咽癌CNE-2细胞的凋亡指数(AI)大于单纯高压氧或单纯放射。(4)体内试验显示2.0ATA高压氧+放射组和2.5ATA高压氧+放射组肿瘤抑制率均大于放射组。高压氧对鼻咽癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用。(5)免疫组化显示高压氧和放射治疗均可上调鼻咽癌p53、Bax基因的表达,且具有协同作用。Western blot和RT-PCR进一步显示高压氧和放射均可上调鼻咽癌p53、Bax基因的表达,且具有协同作用。高压氧上调p53、Bax基因在鼻咽癌组织中的表达,进而促进鼻咽癌细胞的凋亡,增强鼻咽癌的放射敏感性,可能是高压氧对鼻咽癌放射增敏的机制之一。