骨缺损和骨不连,依然是现今创伤性骨折治疗中,外科整形重建所面临最棘手的问题之一,“自体移植”和“异体移植”理论上可以达到最佳的恢复效果,被认为是临床“金标准”。但是上述治疗方法由于内在限制和缺陷,无法达到临床的广泛使用。骨移植由于来源受限,并发症繁多,骨免疫因素等,无法大量开展。组织工程是作为一门新兴交叉学科,发展于20世纪80年代,定义如下：将工程学和的生命科学基本原理技术结合,在体外构建具有生物功能的人工取代物,用于修复组织缺损,替代失去功能或衰竭的组织、器官的部分或全部功能。由此,大量的人工骨材料被开发出来,极佳的生物相容性和骨可替代性使得骨组织工程材料能在临床广泛使用。牡蛎壳等海洋生物贝壳类具有资源丰富,结构致密,强度与皮质骨相当,其纳米颗粒的形成过程于正常骨形成有相似特点,其中碳酸钙(CaCO3)成分是95.994%,是一种十分有潜力的骨替代材料。如果将牡蛎壳合成并加工制作成一种组织工程骨材料,将为临床骨缺损修复提供一种崭新的治疗手段。骨质疏松症是骨科一种常见的全身性骨病,以骨质量损害,骨量减少及骨强度变低,最终导致骨脆性增加,发生脆性骨折为特性。主要的临床表现：周身疼痛,身高降低、发生脆性骨折、驼背以及对呼吸系统影响。骨质疏松症对现今医疗系统负担巨大,在分子水平,骨质疏松症伴随着成骨功能下降和破骨水平升高。在老年人中,骨质疏松症已经成为一项主要的健康问题,确诊之后的后续治疗也是在不断调整。对于骨质疏松症中,关于骨转化和病理机制,越来越多的研究在开展,同时也使得相应的精确靶点治疗成为可能。Rab5作为鸟苷酸-5-三磷酸盐(GTP)结合蛋白家族中的一员,在早期的细胞运动内吞作用过程,核内体的细胞运输和成熟过程中,都起到关键性的作用。在人类细胞中,Rab5有三种不同的亚型存在(RAB5A, Rab5B和Rab5C)三种亚型之间存在重叠的胞内定位和细胞内吞功能的重叠。Rab5的主要定位于早期的内涵体,调控细胞的融合,对接和微管运动。有活性的GTP结合形式下,下游效应器(APPL1和APPL2)被结合,这次结合是区别早期内涵体和调控信号转导-运输货物的重要标志。在本次研究中,探究了Rab5蛋白参与骨系分化和骨重建过程,并在成骨骨骼生长中起到关键作用。本人博士期间从事骨组织工程材料和骨系成骨分化相关研究。已经有多篇SCI论文发表。本课题分为四个部分：一、牡蛎壳组织工程骨材料制备和特性；二、牡蛎壳组织工程骨材料生物学研究；三、Rab5在骨系分化中的作用。四、Rab5敲降/过表达对骨系分化的影响。我们的研究表明,牡蛎壳复合硫酸钙材料可以通过改良乙醇盐溶法成功制取,复合工程骨可弥补单纯硫酸钙骨诱导性缺乏的劣势,早期就能形成碳化羟基磷灰石；复合材料生物相容性佳,促进细胞增殖和成骨基因的表达,股骨缺损修复实验效果明显；Rab5在随着成骨分化过程表达上升,临床骨质疏松症标本证实了这一现象；Rab5过表达促进成骨系分化,而siRNA敲降后抑制了成骨系分化,小鼠颅盖骨体内siRNA注射抑制实验证实Rab5在成骨发育过程中起着关键作用。第一部分：牡蛎壳组织工程骨制备和特性目的：本实验目的是制备全新的生物组织工程骨材料—硫酸钙／牡蛎壳(CS/OS)。探究本材料的微观结构,自固化性能,物相构成,力学特性,体外降解性和体外生物活性。方法：复合材料CS/OS的制备和初步性能检测：使用乙醇盐溶法制备组织工程骨材料—硫酸钙/牡蛎壳。盐溶法制备体系中包括：30%氯化钙,0.25%的丁二酸,乙醇/水比为2：3的水溶液。通过x射线衍射(XRD)检测复合材料的物相信息,场发射扫描电镜(FE-SEM)观察复合材料的微观结构。在加水自固化过程中,我们分别检测各个样品的自固化时间,并根据养护时间点,测试各组力学性能差异。将不同组分工程材料放入人体模拟液(SBF),7天后,运用X射线衍射XRD检测浸润后材料物相,使用带有射线能谱(EDX)功能的场发射扫描电镜FE-SEM检测物质形貌并进行元素分析。将工程材料制成高3mm直径6mm的圆柱体(Φ6mm×3mm),放置于人体模拟液SBF中水浴,统计每组材料浸泡前后损失的重量。同时通过检测各个时间点pH值和Ca2+的浓度,对材料降解周围的微环境进行评估。结果：实验探究了材料的自固化性能,力学特性和体外降解速率。本实验得到如下的结果：相比较纯半水硫酸钙骨水泥CS,复合工程材料硫酸钙／牡蛎壳粉CS/OS自固化时间相对延长11-28分钟。随着养护时间的延长,CS/OS工程材料力学性能在初始凝固之后呈现上升趋势,其中复合工程材料CS/OS 12力学性能最佳。牡蛎壳的添加使纯半水硫酸钙CS具备了体外生物活性,在人体模拟液SBF浸泡7天后,CS/OS材料表面产生了碳素类骨羟基磷灰石,此类羟基磷灰石是最适宜人体成骨的矿物质。另外,相比纯半水硫酸钙,复合材料CS/OS的体外降解速率下降,差异有统计学意义,对于解决临床硫酸钙使用过程中降解过快,具有一定的意义。结论：本实验使用乙醇盐溶液法成功制取牡蛎壳-硫酸钙CS/OS骨组织工程材料,制备得到的牡蛎壳工程材料相比纯半水硫酸钙具有更优良的骨修复材料特性。表现在更佳的降解速率和生物活性获得。为临床骨修复材料制备提供了一种新思路。第二部分：牡蛎壳组织工程骨生物学研究目的：通过使用材料的浸提液和细胞共培养,探究材料对体外细胞增殖和成骨分化的作用。通过股骨髁缺损模型,植入牡蛎壳组织工程骨,评价其骨修复能力。方法：MG63细胞系进行体外相容性实验。材料浸提液培养MG63细胞后,使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)方法,检测细胞的增殖情况并评估材料的体外相容性。并行碱性磷酸酶染色(ALP染色)和钙结节染色(Von Kossa染色)。蛋白质印迹分析(WB),在7,14天时同时检测Ⅰ型胶原(COLI)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)。采用原位股骨髁缺损实验,来评估CS/OS复合材料的骨修复再生效果。结果：细胞增殖实验中,牡蛎壳工程材料CS/OS浸提液处理细胞组尚未发现相关的毒性作用,一定浓度内可促进细胞增殖。ALP染色和Von Kossa染色实验,牡蛎壳工程材料组显示阳性。两个指标BMP-2和COL Ⅰ,通过蛋白质印迹分析WB实验比较,牡蛎壳工程材料组相比较单纯硫酸钙组蛋白明显的上调,有统计学差异。qPCR发现成骨相关基因表达在牡蛎壳材料组明显上调,如BMP-2,Runx2,Osx, and OCN。股骨髁修复实验中,牡蛎壳工程材料组形成的新骨,骨小梁体积更规则致密,骨髓腔清晰完整。单纯硫酸钙组新骨骨小梁稀疏。结论：牡蛎壳复合工程材料具有优良的生物相容性,可诱导成骨分化,同时促进成骨相关蛋白BMP-2和COL Ⅰ的表达。体内骨修复实验也证实了牡蛎壳工程材料良好的骨修复能力。第三部分：Rab5在骨系分化中的作用目的：本研究目的旨在探究Rab5在骨质疏松中成骨分化的作用,应用临床标本和成骨细胞分化模型,观察Rab5表达情况以及成骨相关基因动态变化。方法：收集临床标本,不同阶段的骨质疏松标本,进行免疫组织化学染色,检测不同阶段骨质疏松,Rab5的表达量变化和病情是否有相关性。建立成骨分化模型后,检测成骨相关特异性基因,1型胶原COL1,骨桥蛋白OPN,骨钙素OCN,成骨相关转录因子Runx2和OSX。并行碱性磷酸酶染色,茜素红染色和Vonkossa染色。用免疫荧光共聚焦显徽镜和蛋白印迹Western Blot方法检测不同时间点Rab5含量和成骨特异性蛋白变化。结果：临床骨质疏松病人标本的HE病理切片显示不同的临床骨松阶段,根据病人临床资料,骨密度测量值Bone Mineral Density (BMD),观察到骨小梁规则和致密程度不同,HE病理提示骨质疏松标本符合实验要求。之后对临床标本进行免疫组织化学染色,Sp7即Osterix在骨质疏松病人中表达下降,另一方面,Rab5蛋白表达随着骨质疏松严重程度下调。MC3T3成骨阶段性染色ALP, Alizarin Red和Vonkossa证实成骨模型成功建立。在成骨分化1,3,7,10,14,17和21天时,1型胶原COL1,骨桥蛋白OPN,骨钙素OCN,成骨相关转录因子Runx2和OSX随着成骨分化进行上调,Rab5和其效应蛋白APPL1、APPL2也表现出上调趋势。免疫荧光共聚焦的结果也于上述一致。结论：Rab5和骨质疏松症存在相关性,Rab5和其效应蛋白APPL1,APPL2的上调在MC3T3成骨分化过程中起到关键作用。第四部分：Rab5的敲降/过表达对骨系分化的影响目的：通过siRNA敲降Rab5表达,观察敲降之后对成骨分化的影响。构建Rab5过表达质粒,观察过表达Rab5对成骨分化影响。小鼠颅盖骨内注射siRNA,观察Rab5抑制后对骨发育的影响。方法：设计siRNA,使用siRNA敲降Rab5蛋白,之后开始成骨分化,检测成骨相关Marker的变化,1型胶原COL1,骨桥蛋白OPN,骨钙素OCN,成骨相关转录因子Runx2和OSX。并在相应时间点进行碱性磷酸酶染色,茜素红染色和Vonkossa染色。构建PXJ-40载体的Rab5过表达质粒。通过瞬转导入质粒,观察过表达Rab5蛋白之后,对成骨分化的影响。设计体内siRNA,繁殖C57小鼠,对刚出生幼鼠Day2,注射siRNA并在相应时间点取材,使用MicroCT观察小鼠颅盖骨骨发育情况。并用钙黄素进行组织学染色,阐明在体内Rab5被敲降之后对成骨过程和骨发育的影响。结果：Rab5a、Rab5c在siRNA敲降实验中下降明显,敲降之后开始进行成骨分化,在4,7天时,一型胶原COL1和转录因子Runx2下调,同时磷酸化-AKT也出现下调。过表达Rab5a、Rab5c质粒,瞬转并开始成骨分化,OSX成骨转录因子出现上调,一些其他的成骨指标也维持在较高水平。敲降Rab5的下游效应蛋白APPL1、APPL2也出现类似的现象。7天的时候对Rab5过表达／敲降的细胞进行碱性磷酸酶染色,siRNA敲降Rab5a、5c之后ALP染色阴性细胞率明显上升。21天进行的茜素红染色和Vonkossa染色在Rab5过表达／敲降过程中均没有出现明显变化。小鼠颅盖骨siRNA注射之后,钙黄素染色结果显示Rab5a,Rab5c印制组,骨形成速率减慢。从MicroCT结果显示,小鼠颅盖骨骨缝明显加大,部分区域可见大片颅盖骨缺损。结论：Rab5对于骨系分化是必须的,骨系分化过程中Rab5上调,敲降Rab5会导致成骨分化障碍。体内小鼠颅盖骨敲降实验也证实了Rab5的缺失会造成体内骨发育障碍。