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成瘾物质导致的中毒性脑病常见于酒精、阿片类物质成瘾的人群，主要表现为成瘾和中枢神经系统器质性损害。随着经济的飞速发展，罹患此类疾病的患者数量在我国急剧增加，但是社会和医疗的忽视却与这种现状形成了尖锐矛盾。中毒性脑病的中枢神经系统损害以神经元凋亡为突出表现。患者起病缓慢，后期出现近记忆力减退、缺失，或者有全面智力下降的痴呆表现，部分患者伴有严重的人格改变，或出现感知觉障碍，以错构和虚构为特征。吗啡是目前临床应用最广泛的成瘾物质，已经有多个研究发现，吗啡导致多个系统和器官的细胞死亡和凋亡。体内和体外的实验显示，吗啡处理，尤其是长期的吗啡处理，导致明显的神经元凋亡。但是使用阿片受体的拮抗剂，例如纳洛酮，仅仅能够部分阻断或抑制吗啡诱导的神经元凋亡，因此具体机制仍有待进一步的研究探讨。Toll—likereceptor2(TLR2)是TLRs家族的重要成员之一，能够被多种配体激活并参与机体自身免疫和防御。TLR2广泛表达于多种器官和系统，包括免疫系统和中枢神经系统。TLR2不仅是激活机体自身免疫防御和炎症反应的重要受体，而且广泛参与多种细胞功能，包括细胞凋亡。TLR2信号传导通路的激活能够诱导细胞凋亡基因的活性增高，并且在多个系统和器官导致细胞死亡和凋亡。而且，MyD88，TLR2下游信号通路的关键调节蛋白，在细胞凋亡过程中具有一定的作用；MyD88的抑制体(Dominantnegative，DN)或者MyD88功能缺失均导致细胞凋亡的抑制。此外，已有文献报道TLRs激活Glycogensynthasekinase3β(GSK3β)信号传导通路。GSK3β广泛参与多种细胞功能，并且具有促凋亡和抑制凋亡的双向作用，主要通过在丝氨酸9位置的磷酸化灭活调节其蛋白活性。TLR2信号通路最终激活NF—κB，促进炎症反应和细胞凋亡的发生，包括诱导一系列促凋亡基因的表达。因此，我们设想，TLR2信号通路可能参与成瘾性物质诱导的细胞凋亡，包括神经元凋亡。我们使用临床最常用的成瘾性物质，吗啡作用于细胞，在体外完成一系列的研究。首先，我们使用易操作的HEK293细胞进行研究，通过高表达TLR2和阻断TLR2下游必需的调节蛋白MyD88，分别激活和抑制TLR2信号通路，观察吗啡处理后细胞凋亡的变化，从而初步明确TLR2在吗啡致细胞凋亡中的作用。随后，基于所获得的上述结果，我们使用体外培养小鼠皮层原代神经元细胞进一步探讨TLR2信号通路在吗啡诱导神经元凋亡中的作用。
第一章TLR2信号通路在体外吗啡诱导的人胚肾细胞凋亡中的作用
研究目的:使用体外培养的人胚肾细胞(HEK293)，通过高表达TLR2和阻断TLR2下游必需的调节蛋白MyD88，分别激活和抑制TLR2信号通路，观察吗啡处理后细胞凋亡的变化，从而初步明确TLR2在吗啡致细胞凋亡中的作用。
研究方法:
1.体外培养HEK293和TLR2/HEK293并进行吗啡处理
体外培养的人胚肾细胞(HEK293)和高表达TLR2的HEK293(TLR2/HEK293)细胞，使用不同浓度(1μM，3μM，10μM，30μM)和不同时间(12h，24h，48h)吗啡处理。
2.基因转染
将携带μ—阿片受体基因或DNMyD88的质粒转染入实验各组的细胞。携带绿色荧光蛋白基因的质粒作为对照组。使用脂质体作为载体，将质粒转染入各组细胞。转染48h后，将培养基更换为含1％胎牛血清的RPMI-1640培养基，并进行后续实验。
3.细胞存活率检测
细胞存活率检测使用MTT法。将细胞铺在96孔培养板内。各组细胞被转染入对应的质粒后，使用不同浓度吗啡处理。将MTT加入96孔板内，随后将培养板置于37℃孵育4h。最后使用ELISA读数仪器在570nm波长光下检测显色度。
4.细胞凋亡检测
收集细胞使用PI染色液重悬并室温孵育30min，样本使用流式细胞仪检测细胞凋亡。
5.Western Blotting
使用WesternBlotting检测细胞被转染携带DNMyD88的质粒后，DNMyD88的蛋白水平变化。实验各组细胞被收集后使用RIPALysisBuffer裂解并离心后用10％SDS—PAGE将样品电泳分离，并转至硝酸纤维膜。将膜置于溶解5％脱脂的1×TBS封闭溶液室温孵育1小时，随后使用特异性抗体于4℃孵育过夜，再使用二抗孵育1小时。最后曝光并扫描纪录结果。
6.统计学处理
各组数据均为三次重复实验获得结果，所有统计学实验数据均以均数±SEM表示。使用ANOVA分析判断组间的统计学差异。P＜0.05被认为有显著性差异。
使用MyD88抑制体竞争性抑制MyD88并阻断TLR2信号通路后，吗啡诱导的TLR2高表达细胞的凋亡也明显减少。
结论:
激活TLR2导致吗啡处理后细胞存活率下降，细胞凋亡增高。阻断TLR2信号通路后，吗啡诱导的TLR2高表达细胞的凋亡明显减少。因此，TLR2信号通路参与吗啡诱导的细胞凋亡。
第二章TLR2信号通路在吗啡诱导神经元凋亡中的作用
研究目的:基于我们在使用HEK293细胞进行的体外研究中发现了TLR2参与吗啡诱导的细胞凋亡，我们使用体外培养原代神经元细胞进一步明确TLR2在吗啡诱导神经元凋亡中的作用，并探讨在此过程中可能涉及的TLR2下游信号通路。
研究方法:
1.小鼠皮层原代神经元培养并使用吗啡处理
从野生型小鼠分离培养正常神经元，从TLR2基因敲除小鼠分离培养TLR2功能缺失神经元，于体外培养第七天后分别使用不同浓度(5μM，15μM，50μM)处理，最长作用时间为6d。
2.死亡细胞检测
神经元的细胞密度使用相差显微镜在细胞培养过程中观察。各个实验组在处理结束后，使用PI染色，在荧光倒置显微镜下检测死亡细胞并计数[39]。每个培养皿的计数结果为5个视野细胞计数的均数。统计结果以正常对照组为基数由百分数表示。
3.TUNEL测定神经元凋亡
神经元经过15μM吗啡处理6天后，将其用丙酮/甲醇(50/50)室温固定5分钟，随后按照TUNEL试剂盒指示进行操作。结果在显微镜下观察。
4.实时反应RT—PCR
使用实时反应RT—PCR检测正常神经元在吗啡处理后TLR2的mRNA水平的变化。15μM吗啡处理组和未处理组神经元在对应时间内被收集至EP管内，完成RNA抽提。每个样品使用1μg总RNA逆转录成为cDNA。70℃反应3分钟，37℃反应10分钟，随后将逆转录产物进行实时反应PCR。GAPDH作为实验内参。
5.Western Blotting
使用WesternBlotting检测正常神经元和TLR2功能缺失神经元经吗啡处理后cleavedcaspase—3，caspase—3，p—Ser9-GSK3β，total—GSK3β，p—Akt等蛋白水平的变化，以GAPDH作为内参。
6.细胞免疫荧光染色
使用细胞免疫荧光染色检测正常神经元和TLR2功能缺失神经元经吗啡处理后TLR2，cleavedcaspase—3，p—Ser9-GSK3β等蛋白水平的变化。丙酮/甲醇室温固定5分钟，将固定后的神经元使用一抗室温孵育过夜，继之以二抗室温避光孵育2小时。使用LeicaTCSSP2LaserScanning共聚焦显微镜和荧光倒置显微镜观察实验结果。
7.统计学处理
各组数据均为三次重复实验获得结果，所有统计学实验数据均以均数±SEM表示。使用ANOVA分析判断组间的统计学差异。P<0.05被认为有显著性差异。
结论：TLR2参与吗啡诱导的神经元凋亡；GSK3β可能参与吗啡介导的TLR2信号传导通路；caspase—3是TLR2介导吗啡致神经元凋亡的重要执行因子；阻断TLR2功能可明显抑制吗啡诱导的神经元凋亡。