RNAi干扰技术在生物节律相关基因hper1和clock研究中的应用

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RNA干扰(RNAi)是指内源性或外源性双链RNA通过一定的作用机制导致细胞内特定基因在mRNA水平上的表达显著降低。RNA干扰技术是过去十年里基因组学方面最引人注目的发现之一,该技术是应用21nt的短双链RNAs作为一个短干扰RNAs(siRNAs)当它介入到哺乳动物细胞内时有效的抑制RNA的表达。RNA干扰技术因其具有高度特异性和显著的干扰效果,而在研究和应用领域受到高度重视。时间生物学的研究表明,人类的很多生命活动具有一定的节律。在各种不同周期的节律当中,近日节律是最引人注意,被研究最多的。Circadian,是一个最近几十年才出现的词。它被用来描述周期大概为24小时的节律。人类有很多节律活动的周期接近24小时。近日节律(circadian rhythms)由生物钟(近日节律钟)系统产生和调控。该系统在调节生物的生理功能,并使之与外界环境相适应方面起着重要的作用。目前研究证明PER1是近日节律分子振荡中的关键性蛋白,主要通过蛋白与蛋白作用的方式发挥功能。但PER1通过何种途径发挥作用目前还不十分清楚。因此本文构建针对hper1的高效RNA干扰质粒,为进一步研究hper1的功能构建平台,并在此基础上对hper1的功能进行初步研究。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-Ⅱ干扰质粒干扰效率最高,hper1表达量降低84.9%。Western Blot显示hPER1表达受抑制后,P—p44/42 MAPK水平升高。在哺乳动物,节律基因per1,per2,Bmall,Clock和cry1已经在精子生成过程中被发现但却不是以近日节律的形式存在。值得注意的是Clock基因的表达仅仅在圆形精子的顶体被发现,这一发现推测Clock基因在雄性动物的生殖能力中可能起到了潜在的作用。因此在本研究中我们利用RNAi技术干扰clock在小鼠睾丸中的表达,结果westernblot显示在注射clock干扰质粒后3天和6天clock表达量分别下降55%和48%,为进一步探讨clock对小鼠生殖功能的影响构建平台,并在此基础上对clock对小鼠生殖功能影响进行初步研究,
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