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目的:在本课题组前期工作中发现,胆管癌经与脂肪细胞共培养后可以增加胆管癌细胞的辐射抗性,通过高通量蛋白质组学联合生物信息学分析在受照后与脂肪共培养的胆管癌细胞中筛选到与胆汁酸的解毒、排出机制有关的可溶性磺基转移酶超家族成员——胆盐磺基转移酶(Bile Salt Sulfotransferase,SULT2A1)。本研究将进一步明确胆汁酸代谢发生变化与调控胆管癌放射敏感性的相关性及潜在调控机制。方法:首先,通过X-RAD SmART小动物放射治疗模拟定位仪单次30Gy精准照射小鼠肝胆区域,并经透射电镜及血生化分析确定模型的成功建立;然后采用靶向代谢组学检测小鼠肝胆组织中辐射响应性胆汁酸。随后,通过CCK-8法筛选出辐射响应性胆汁酸成分对两株胆管癌细胞的毒性作用,通过流式细胞术分析胆汁酸对受照后胆管癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的作用,然后经细胞克隆形成实验初步明确鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是对胆管癌细胞的放射敏感性具有显著影响的胆汁酸成分之一。后续实验中,采用磷酸化γ-H2AX焦点的免疫荧光染色法和中性单细胞凝胶电泳实验明确CDCA对受照后胆管癌细胞DNA双链断裂的具体影响,通过Western-blot法检测CDCA对受照后胆管癌细胞中DNA损伤修复相关蛋白Rad50、Mre11、Ku-80表达的影响。进一步采用通路特异性拮抗剂,结合免疫荧光染色法及流式细胞分析法明确CDCA是否经核受体法尼醇X受体(farnesol X receptor,FXR)通路介导其对胆管癌细胞放射敏感性的调控作用。最后,采用高通量RNA测序结合生物信息学分析方法,探讨CDCA/FXR信号途径参与调控胆管癌细胞放射敏感性的下游关键效应分子与潜在分子机理。结果:肝胆区域接受单次30 Gy照射后2周,未见明显肝功能异常表现,超微结构可见显著改变;靶向代谢组学检测结果显示,受照后肝脏组织中初级胆汁酸CDCA和次级胆汁酸熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)显著降低,而次级胆汁酸牛磺酸脱氧胆酸(taurodeoxycholic acid,TDCA)和甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid,GDCA)对照组相比则显著增加。CCK-8实验显示CDCA在200μM浓度下可使80%的胆管癌细胞存活,其余胆汁酸成分对胆管癌细胞并无明显毒性作用,因此选取该浓度用于后续功能实验。与单纯照射组相比,CDCA可显著缓解胆管癌细胞中由辐射诱导的G2/M期阻滞、减轻细胞凋亡现象的发生;而其余辐射响应性胆汁酸并无上述作用。因此后续实验将主要探讨CDCA的对胆管癌放射敏感性的生物学作用。克隆形成实验结果表明,CDCA可显著增加受照后胆管癌细胞的存活分数,生存曲线经拟合多靶单击模型,算得放射增敏比(SER)为0.83<1,明显使胆管癌细胞放射敏感性降低。CDCA可显著降低X线照射后胆管癌细胞核磷酸化γ-H2AX焦点的形成、缓解胆管癌细胞DNA损伤脱尾的程度,并增强受照后胆管癌细胞中DNA损伤修复相关蛋白的表达。CDCA可激活RBE细胞中FXR,使之从细胞质进入细胞核;FXR拮抗剂Guggulsterone在一定程度上可逆转CDCA对受照后胆管癌细胞周期分布、细胞凋亡的影响。与单纯8Gy X射线照射组相比,RNA测序法在CDCA联合照射组细胞中筛选到496种差异表达基因,其中150种基因表达下调,346种基因表达上调。生物信息学分析发现,上述差异基因主要参与了:调节胆固醇的生物合成、胆固醇的生物合成、固醇类的生物合成等生物学过程;细胞定位分析显示:差异基因主要是定位在半桥粒、细胞外间隙、细胞质膜等细胞的结构部位;差异基因进行分子功能的分析表明大部分差异基因所参与的分子功能主要涉及:酪氨酸蛋白激酶的结合、胶原蛋白的连接、受体结合等细胞分子功能。另外,差异基因的KEGG信号通路分析结果显示:PI3K-AKT信号通路、蛋白多糖与肿瘤的相关信号通路、松弛肽信号通路、雌激素信号通路、TGF-β信号通路、类固醇的生物合成、脂肪酸的生物合成等信号通路也可能参与到了 CDCA调控胆管癌细胞放射敏感性的过程之中。最后,基因富集分析(GSEA)结果也表明:PI3K-AKT信号通路、脂肪酸链延长合成的信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞周期相关的信号通路等通路也可能参与其中。结论:初级胆汁酸CDCA可增加胆管癌细胞的辐射抗性,其机制可能与CDCA激活胆管癌细胞中的特异性核受体FXR,进而影响下游关键靶基因的表达有关。CDCA/FXR胆汁酸代谢通路可能具备潜在的胆管癌治疗新靶点的可能性。