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卵母细胞是雌性生殖能力的核心,卵母细胞的生长发育是一个包括核成熟和胞质成熟相互协调的过程。纺锤体组装和染色体排列需要精密的调控,以保证卵母细胞减数分裂的有序进行,否则会导致非整倍体卵母细胞的产生,造成胚胎死亡或生出有缺陷的后代。因此,维持卵母细胞基因组的完整性和遗传稳定性具有重要的生物学意义。虽然已有各种不同的分子被发现与卵母细胞纺锤体、染色体缺陷有关,但调节减数分裂的通路和机制仍不十分明确。Rab蛋白是一类小GTP酶,广泛参与细胞内各种生理活动,但其在减数分裂过程中的作用鲜有报道,为了研究Rab家族蛋白Rab5a和Rab6a在减数分裂中的功能作用及通路,本研究以小鼠卵母细胞为材料,通过吗啉基低聚物(Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer, PMO)和RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术,分别敲低Rab5a和Rab6a,并运用免疫荧光染色法及激光共聚焦技术来研究Rab5a和Rab6a在卵母细胞减数分裂过程中的作用,并探讨其作用机理。本研究共包括以下6个部分：试验一、Rab5a在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用本试验旨在通过显微注射Rab5a吗啉基(Rab5a morpholino, Rab5a-MO)特异性降低Rab5a蛋白在卵母细胞中的表达,并通过免疫荧光染色研究Rab5a蛋白在小鼠卵母细胞中的定位及其在减数分裂过程中对纺锤体、染色体和动粒的影响。结果表明,Rab5a以囊泡形式分布在小鼠卵母细胞中,在GV期聚集在核区,随着减数分裂进行,均匀分布在胞质中；在后末期聚集在纺锤体／染色体区域。这一动态的分布变化提示,Rab5a可能与纺锤体／染色体的稳定或减数分裂进程相关。特异性敲低Rab5a后,发现卵母细胞第一极体(pbl)排出率明显下降(P<0.05)；免疫荧光染色结果显示,Rab5a表达降低会导致纺锤体异常率和染色体中板排列异常率显著增加(P<0.05)。通过对动粒及纺锤体的免疫荧光共染发现,Rab5a表达降低会引起动粒-微管作用异常率升高(P<0.05),说明Rab5a的缺失可影响动粒微管作用,进而影响染色体的迁移。核型分析结果表明,Rab5a蛋白表达降低会导致卵母细胞染色体非整倍体比例升高,证明Rab5a影响了减数分裂的正常进行。本试验表明Rab5a在小鼠卵母细胞减数进程中具有重要的作用。试验二、Rab5a影响减数分裂的信号通路探讨本试验通过对核纤层蛋白(Lamin)、核有丝分裂器蛋白(NuMA)、着丝粒蛋白F(CENPF)分别进行免疫荧光染色,研究Rab5a对这3种蛋白的影响,以期找到Rab5a影响纺锤体形态和染色体排列的可能原因。试验结果表明,小鼠GV期卵母细胞存在着完整的Lamin,随着减数分裂进行,核膜消失,Lamin也拆解消失,而Rab5a可影响Lamin在减数分裂过程中的正确拆解。Rab5a敲低后,减数分裂中期本应拆解完成的核纤层残留比例会显著高于正常组(P<0.05)；NuMA蛋白在GV期与Rab5a蛋白具有相似的亚细胞定位,在减数分裂中期聚集在纺锤体两极,但激光共聚焦和定量分析结果显示,Rab5a缺失对于NuMA的定位或水平无显著影响；CENPF在GV期位于核基质中,随着减数分裂进行,采用双标记法证明CENPF在卵母细胞第一次减数分裂中期(MI)伴随着着丝粒分布。值得注意的是,免疫染色和蛋白印迹结果表明,敲低Rab5a可导致定位于着丝粒的CENPF显著减少。表明Rab5a对于Lamin的正确拆解十分重要,并显著影响卵母细胞减数分裂过程中CENPF在着丝粒的表达。试验三、CENPF介导Rab5a对减数分裂的调控已知Rab5a缺失对CENPF的定位和表达水平有剧烈影响,我们认为在Rab5a-MO卵母细胞中观察到的减数分裂的缺陷,其中至少一部分是由CENPF功能的缺失所造成的。基于这一假设,本试验将CENPF标记的吗啉基(CENPF-MO)注射到小鼠GV卵母细胞后进行体外培养,再使用抗微管蛋白抗体染色,并观察纺锤体,用碘化丙啶(PI)对染色体进行复染。结果显示CENPF-MO注射后,CENPF水平下降,说明CENPF-MO注射可以起到敲低CENPF的作用。在敲低CENPF的卵母细胞中,出现了与Rab5敲低类似的纺锤体形态变化和染色体排列异常,以及动粒-微管作用的异常。同时注射CENPF-MO和Rab5a-MO,结果发现表型异常率与各自单敲低无显著差异,且无叠加作用。说明Rab5a与CENPF不是协同关系,而是处于同一作用通路。这些结果提示在卵母细胞成熟过程中,CENPF可能是一个主要的Rab5a在减数分裂中作用的调控对象。试验四、Rab6a在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用本试验通过显微注射siRNA来干扰Rab6a mRNA,降低其蛋白表达,以期分析Rab6a对卵母细胞减数分裂的影响。首先对3组供试的合成siRNA进行筛选,选出对Rab6a mRNA降低效果最好的一组,并用western blot验证其对蛋白表达效果的影响,随后观察对照组及RNAi组小鼠卵母细胞体外培养情况,并进行免疫荧光染色,标记其纺锤体及染色体,激光共聚焦显微镜观察。结果表明,在经过RNAi后Rab6a的蛋白表达水平明显下降,说明该法可获得良好的敲低(knock-down, KD)效果,细胞培养发现,卵母细胞pbl排出率与对照组相比显著下降(P<0.05)；激光共聚焦结果显示,Rab6a影响染色体的中板排列(P<0.05),表明Rab6a在小鼠卵母细胞减数进程中具有重要的作用。试验五、Rab6a对减数分裂过程中细胞器的影响Rab6a作为一种小GTP酶,与囊泡运输密切相关。本试验通过显微注射敲低Rab6a,研究Rab6a对卵母细胞减数分裂过程中囊泡运输相关的细胞器的影响,从而了解其在囊泡运输中的作用。对照组和Rab6-KD组通过免疫荧光染色标记皮质颗粒分布和活细胞染色标记内质网和高尔基体,激光共聚焦显微镜分析Rab6a在减数分裂过程中对皮质颗粒分布、内质网和高尔基体的影响。结果发现,Rab6a敲低后皮质颗粒的分布受到显著影响,MII期卵母细胞未出现无皮质颗粒区(cortical granules free domain,CGFD)的比例升高(P<0.05),高尔基体分布和荧光强度无明显变化,内质网在GV和MI期卵母细胞的分布和荧光强度均出现异常(P<0.05)。研究结果表明,Rab6a对减数分裂过程中皮质颗粒分布和内质网具有显著影响,Rab6a的敲低可能影响囊泡向膜及内质网的运输,从而造成皮质颗粒和内质网异常。试验六、猪卵母细胞老化的分子调控初探卵母细胞质量对受精和其后的发育十分重要。研究卵母细胞老化,延缓老化过程具有重要的应用价值。本试验以猪卵母细胞为材料,建立老化模型,使用Sirt1蛋白激活剂白藜芦醇添加培养,并运用免疫荧光染色及激光共聚焦技术研究白藜芦醇对延缓卵母细胞老化的作用及机理。去乙酰化酶(Sirtuins)已被广泛报道与多样的生物进程有关,影响细胞周期,但它们在猪卵母细胞老化过程中的作用尚未见报道。白藜芦醇是Sirt1的激活剂,可通过激活Sirt1活性参与生物进程。为了研究猪卵母细胞老化过程,采集猪2-51mm卵泡卵母细胞,分3组作体外成熟培养：对照组培养44 h,老化组培养68 h,白藜芦醇处理组添加2州白藜芦醇培养68 h。首先用western blot检测培养68 h老化组(体外老化24 h)猪卵母细胞Sirtl蛋白表达,结果发现Sirt1表达在老化组卵母细胞显著降低,同时免疫荧光染色结果发现猪卵母细胞存在卵周隙增大、纺锤体和染色体异常率增加,皮质颗粒分布异常率升高,线粒体分布异常且表达量降低。白藜芦醇处理组卵母细胞的卵周隙、纺锤体、染色体、皮质颗粒和线粒体异常比例均显著低于老化组；除皮质颗粒异常率较对照组差异显著外,其余参数均接近对照组(P>0.05)。试验表明,在猪卵母细胞体外老化过程中,白藜芦醇对延缓卵母细胞的老化具有积极作用。