家蚕丝胶蛋白、羽毛角蛋白降解细菌的分离与角蛋白酶发酵培养基的优化

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选择山东省临沂市沂水县华银丝厂和山东省泰安市泰银丝厂废水样品,利用选择性培养基对家蚕丝胶蛋白及羽毛角蛋白降解细菌进行了分离筛选。采用细菌基因组重复序列PCR技术(简称REP-PCR),对具有降解丝胶蛋白能力的细菌进行了聚类分析。采用菌落形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列同源性分析,对10株既可降解家蚕丝胶蛋白又可降解羽毛角蛋白的细菌进行了鉴定。以有机溶剂处理的角蛋白为底物测定了羽毛角蛋白降解细菌的角蛋白酶活性,并选取角蛋白酶活性最高的芽孢杆菌(Bacillus pumilus)S59进行了产角蛋白酶发酵培养基的优化。主要结果如下。从制丝厂的废水池中分离获得39个可以降解家蚕丝胶蛋白的细菌分离株,采用考马斯亮蓝G-250法测定了各分离株对丝胶蛋白的降解活性,其降解率介于2.69%~28.86%之间。各分离株的REP-PCR聚类分析结果表明,在REP-PCR图谱的相异百分数为0.9的水平上被聚类为12个类群。自39株家蚕丝胶蛋白降解细菌中分离得到10株羽毛角蛋白降解细菌。10株降解细菌的角蛋白酶活性介于7.06 U~13.49 U。通过菌落形态特征、生理生化特征及16S rRNA碱基序列测定和同源性分析,鉴定10株细菌均为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。上述菌株的16S rRNA序列已在GenBank注册。通过单次单因子试验确定了S59菌株产角蛋白酶摇瓶发酵培养基的最佳碳源、氮源、碳氮配比和无机盐。培养基优化过程中,在单因素分析的基础上,首先用部分因子试验分析了培养基组分玉米粉、葡萄糖、羽毛和CaCO3对角蛋白酶活性的影响,结果表明玉米粉和羽毛为主要影响因子,且在中心点水平对酶的活性均为负影响,因此,要提高酶活需降低它们的用量;葡萄糖与CaCO3对酶活影响不显著,采用低水平用量作为最佳产酶水平。然后用中心组合设计和响应面分析,确定了主要影响因子的最佳浓度。S59菌株产角蛋白酶的最佳发酵培养基配方为:葡萄糖5.00 g,玉米粉32.83 g,羽毛10.67 g,CaCO3 3.00 g,蒸馏水1000 mL。运用最佳发酵培养基摇瓶发酵,发酵液的角蛋白酶活性达到41.04 U,较基础发酵培养基发酵液的酶活(13.49 U)提高204.23%。
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