研究背景免疫反应的合理调控对于维持中枢神经系统内环境的稳态发挥着重要作用。然而,当免疫反应的调节失去平衡时,过度的神经炎症就会产生,进而对中枢神经系统的细胞和组织造成损伤。越来越多的研究表明,神经炎症参与众多中枢神经系统疾病的发病过程,这些疾病包括缺血性脑卒中、创伤性脑损伤和神经退行性疾病如帕金森病(Parkinson’ sdisease,PD)、多发性硬化(multiple sclerosis, MS)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等。因此,以神经炎症的调控为切入点进行相关研究有助于加深对中枢神经系统炎性疾病病理过程的理解,同时也有益于发现相关疾病的新治疗靶点。危险相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)的出现作为组织和细胞受损的信号被认为是一种警报素,预警着损伤发生的同时又进一步介导一系列无菌性炎症反应的产生,从而在适应性免疫和固有免疫反应中发挥重要作用。高迁移率蛋白B-1(high mobility group-1 protein, HMGB1)是DAMPs中的重要一员,正常情况下大部分HMGB1作为一种非组蛋白染色体结合蛋白存在于细胞核内,当有病原体的刺激或者组织的损伤出现时,HMGB1将会被主动或者被动的释放至胞外,进而与免疫细胞表面相应的模式识别受体结合启动细胞内一系列的信号转导,最终引起强烈的炎症反应。HMGB1的释放存在于多种中枢神经系统疾病的发病过程中,这些疾病包括缺血性脑卒中、创伤性脑损伤、AD. PD和MS等。细胞外的HMGB1与小胶质细胞或者浸润在受损组织中的巨噬细胞表面的糖基化终末产物受体(the Receptor of Advanced Glycation Endproducts, RAGE)、Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)-2. TLR-4或者巨噬细胞表面分子抗原(macrophage antigen complex 1, Macl)等受体结合,募集核内的髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)进而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),随后诱导核因子-κB (Nuclear Factor-κB, NF-κB)合成并释放一系列炎症因子,最终导致细胞和组织的损伤。与此同时,被激活的小胶质细胞和受损的神经元又可以进一步主动或者被动的释放HMGB1从而引起新一轮炎症因子的释放,加重对神经和血管组织造成的炎性损伤,因此而形成一个恶性循环,推进疾病的发生和发展。近年来有关HMGB1促炎作用的研究越来越深入,然而,针对HMGB1所介导炎症过程的负性调控机制还所知甚少。调节性RNA酶-1(regulatory RNase-1, Regnase-1),又名Zc3h12a或者单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein, MCPIP),是一个具有内切酶活性的CCCH型锌指蛋白。Regnase-1可以通过特异性识别炎症因子mRNA3’端非编码区的茎环结构降来解炎症因子的mRNA,这些炎症因子包括括白介素(interleukin, IL)-1β/2/6/12β,干扰素-γ (interferon-γ, IF-γ)等。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein l,MCP-1),脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和IL-1β被证实可以通过NF-κB或MAPK信号通路引起Regnase-1的有效转录与表达。在中枢神经系统中,Regnase-1被报道参与电针预刺激诱导的大脑缺血耐受效应和二甲胺四环素针对缺血性卒中损伤产生的神经保护效应。除此之外,Regnase-1可通过调节促炎因子的表达参与LPS介导的大脑缺血耐受。而有关微小核糖核酸(microRNA, miRNA)-9可通过抑制Regnase-1从而激活小胶质细胞的研究进一步说明了Regnase-1具有潜在的炎症调控作用。综合以上研究结果,我们可以推测Regnase-1具有减轻中枢神经系统神经炎症损伤的潜力。因此,在中枢神经系统中,综合HMGB1的促炎作用和Regnase-1抑制炎症的潜力,再加之考虑到Regnase-1的生成过程和HMGB1的促炎过程均涉及NF-κB和MAPK等信号通路,由此我们提出假说——Regnase-1可被HMGB1诱导表达从而负性调节HMGB1介导的炎症过程和神经损伤作用。本研究将以中枢神经系统最重要的炎症细胞之一——小胶质细胞做为研究对象,通过一些列实验探究HMGB1是否能诱导小胶质细胞Regnase-1的表达增加,并通过功能缺失的实验方法研究Regnase-1是否对HMGB1介导的炎症具有负性调节效应；最后,通过探究HMGB1刺激下Regnase-1对神经元是否具有保护作用去评价Regnase-1在神经炎症损伤过程中对神经组织的保护潜力。研究目的1.明确HMGB1刺激下BV2细胞(小鼠小胶质细胞株)炎症因子的表达变化情况。2.明确HMGB1的刺激是否诱导Regnase-1在BV-2细胞中表达增加。3.明确HMGB1的刺激是否诱导Regnase-1在大鼠脑内表达增加,并明确其表达与小胶质细胞的共定位情况。4.在HMGB1刺激下,Regnase-1的敲低是否使BV-2细胞炎症因子的表达进一步增加并加重HMGB1诱导的炎症对神经元的毒性损伤作用。研究方法1.检测HMGB1刺激下,BV-2细胞炎症因子的表达变化使用DMEM培养基加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)在37℃恒温培养箱中培养(5%CO2,95%空气)BV-2细胞,当细胞生长密度到达约80%时,使用不同浓度的HMGB1(0,0.1,0.5及1 u g/ml)分别刺激BV-2细胞24小时,另外使用HMGB1(1 μg/ml)分别刺激BV-2细胞0,4,12及24小时,采用荧光定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)检测炎症因子11-1β, IL-6和肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-α, TNF-α) mRNA的表达水平,明确HMGB1刺激下BV-2细胞炎症因子的表达变化。2.检测HMGB1刺激下,BV-2细胞Regnase-1的表达变化使用DMEM培养基加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)在37℃恒温培养箱中培养(5%CO2,95%空气)BV-2细胞,当细胞生长密度到达约80%时,使用HMGB1(1μg/ml)分别刺激细胞0,4,12及24小时。另外用不同浓度的HMGB1(0,0.1,0.5及1μg/ml)分别刺激BV-2细胞24小时。最后采用qPCR的方法检测Regnase-1 mRNA的表达水平,明确HMGB1刺激下BV-2细胞Regnase-1的表达变化。3.检测HMGB1刺激大鼠鼠脑后Regnase-1在脑内的表达情况分别向Wistar大鼠右侧侧脑室注射HMGB1(8μg/kg)或生理盐水(对照组),24小时后麻醉大鼠,用PBS进行心脏灌注。(1)取出脑组织,分别提取两组大鼠脑蛋白进行蛋白免疫印迹(Western blot),检测并对比两组大鼠脑内Regnase-1蛋白的表达。(2)使用4%甲醛灌注固定鼠脑,取出脑组织使用不同浓度蔗糖脱水后进行冰冻切片,采用免疫组化观察两组大鼠鼠脑Regnase-1的表达,采用免疫荧光检测Regnase-1与小胶质细胞的共定位情况。4. HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2细胞,检测细胞产生炎症因子的表达变化将Regnase-1特异性siRNA转染BV-2细胞(si-Zc3hl2a组),错义序列siRNA转染BV-2细胞作为阴性对照(siControl组)。转染后使用相同浓度的HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2细胞1小时,提取细胞总RNA,逆转录后行qPCR特异性扩增Regnase-1以及炎症因子IL-13、IL-6、TNF-α的cDNA,和对照组进行对比显示Regnase-1和炎症因子的表达变化。采用Western blot和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV2细胞后,I1-1β蛋白的表达和分泌变化。5.HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2细胞,检测其上清对SH-SY5Y细胞的毒性实验分为两组,si-Zc3hl2a组(敲低Regnase-1组)及si-Control组(对照组),两组BV-2细胞完成转染后,用HMGB1 (1μg/ml)刺激细胞1小时,收集细胞上清。将细胞上清与SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞株)共孵育8,12或24小时后,采用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit, CCK-8)检测SH-SY5Y细胞的细胞活性,并在光学显微镜下观察细胞状态；采用Annexin V-FITC/PI染色后在流式细胞仪上检测SH-SY5Y细胞的死亡率。6.统计分析本研究全部数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行分析,两组间比较采用独立样本t检验分析；多组间比较采用单因素方差分析,方差齐时采用Turkey法,当方差不齐时采用Dunnett’T3法；两因素比较时采用two-way ANOVA,方差齐时采用Turkey法,当方差不齐时采用Dunnett’T3法。检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果1.不同浓度的HMGB1(0.1,0.5和1μ g/ml)刺激BV-2细胞24小时,IL-1 β、IL-6和TNF-α表达均升高,且呈剂量依赖性。HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2细胞不同时间(0、4、12和24小时),4小时后IL-1 β和IL-6的mRNA表达至高峰,且直至24小时仍有表达升高；TNF-α mRNA水平的升高表现为双向模式。2.不同浓度的HMGBl (0.1,0.5和1μg/ml)刺激BV-2细胞24小时,Reganse-1的表达升高,且呈剂量依赖性。HMGB1 (1μg/ml)刺激BV-2细胞不同时间(0、4、12和24小时),4小时后Regnase-1的mRNA表达至高峰,且直至24小时仍有表达升高。3. Western blot和免疫组化的结果表明,侧脑室注射HMGB1组的大鼠鼠脑较对照组的Regnase-1蛋白表达增多。免疫荧光显示HMGB1刺激后,大鼠脑内表达增多的Regnase-1与小胶质细胞存在共定位。4. qPCR结果显示敲低Regnase-1后,HMGB1刺激BV-2细胞1小时,IL-1 β、IL-6的mRNA表达较未敲低组表达增高(P＜0.05)。Western blot和ELISA结果显示敲低Regnase-1后,HMGB1刺激BV-2细胞1小时,IL-1 β的蛋白表达和分泌较未敲低组增高。5.HMGB1刺激敲低或未敲低Regnase-1的BV-2细胞后收集细胞上清,然后将细胞上清与SH-SY5Y细胞共孵育8、12或24小时,CCK-8实验结果和光学显微镜下的观察均显示,对比未敲低组,敲低Regnase-1后的细胞上清孵育SH-SY5Y细胞12小时后细胞活性更低(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞仪检测显示,对比未敲低组,敲低Regnase-1后的细胞上清孵育SH-SY5Y细胞12小时后细胞死亡率更高(P(0.05)。结论1.本研究通过体外实验证明了HMGB1诱导小胶质细胞株BV-2细胞的Regnase-1表达增加,同时在体内实验中验证了HMGB1诱导Regnase-1表达增加且与小胶质细胞存在共定位,可为HMGB1介导的中枢神经系统炎症相关疾病的研究提供研究基础。2. Regnase-1负性调节HMGB1刺激下BV-2细胞中炎症因子的表达,HMGB1刺激敲低Regnase-1的BV-2细胞后,IL-1β、IL-6表达进一步增加,证明了小胶质细胞表达的Regnase-1参与负性调控HMGB1介导的神经炎症反应。3. HMGB1刺激敲低Regnase-1后的BV-2细胞,收集上清孵育SH-SY5Y细胞,细胞活性较未敲低组进一步降低、死亡率进一步增高,说明Regnase-1调控了HMGB1介导的神经元毒性作用,论证了Regnase-1在HMGB1介导的神经炎症过程中具有神经保护的潜力。