红苞凤梨嵌合叶片白化关键基因的筛选及AbhemC基因的克隆与功能验证

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红苞凤梨(Ananascomosusvar.bracteatus)作为重要的花叶观赏植物,其嵌合形状明显,嵌合方式多样,深入研究其叶色镶嵌形成机理对提高嵌合性状在繁育过程中的稳定性和嵌合性状的分子改良具有重要意义。本文以红苞凤梨金边嵌合体经组织培养获得的嵌合性状分离的全绿、全白植株为典型材料,确定了红苞凤梨叶片白化细胞叶绿素合成受阻的关键步骤,筛选出叶片白化失绿突变的关键基因。并对AbhemC进行了克隆、表达分析和功能验证,探讨了其在红苞凤梨叶片白化中的作用,为进一步分析红苞凤梨叶片白化的分子机理提供理论依据。获得的主要研究结果如下:1、红苞凤梨白化叶片叶绿素合成关键步骤的确定及白化关键基因的筛选。通过RNA-seq高通量测序,得到全绿、全白植株间差异表达的基因(DEG)共1431个。通过对DEGs进行COG、GO和KEGG功能注释分析发现,DEGs富集在叶绿素合成、叶绿体发育和光合作用等方面。通过KEGG功能注释得到13个在叶绿素合成代谢过程中差异表达的基因。采用RT-qPCR对这13个DEGs在红苞凤梨组培全绿、全白植株中的表达模式分析表明,11个DEGs在全白植株中上调表达,只有2个POR基因在全白植株中下调表达。RT-qPCR表达分析结果验证了表达谱测序数据的可靠性。对红苞凤梨组培全绿、全白植株的叶绿素及叶绿素合成前体等相关物质含量进行测定,发现白化叶片叶绿素生物合成受阻的限速步骤是PBG向UroⅢ的转化。催化PBG转化为UroⅢ的胆色素原脱氨酶(PBGD)和尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)的酶活性在全白叶中显著降低。结合转录组数据的差异可以推测,hemC基因可能是关键基因,hemC基因编码蛋白(PBGD)的功能受抑可能是白化细胞形成的关键因素。2、红苞凤梨AbhemwC基因的克隆及序列分析克隆得到2个AbhemC基因的cDNA序列,分别命名为AbhemC1和AbhemC2,两个基因全长1135bp,ORF序列1116bp,编码371个氨基酸,核酸序列比对有9个位点的碱基差异,氨基酸序列有2个位点的残基差异。两个基因都属于hemC基因家族,具有hemC基因家族的特征保守域和保守氨基酸位点:该基因编码的蛋白与其他物种具有很高的保守性,相似性78%-82%,并构建系统进化树进行了分析。3、AbhemC基因在烟草中的功能鉴定选取AbhemC基因的保守序列,构建干扰表达载体pFGC5941-AbhemC,利用农杆菌介导分别将干扰表达载体pFGC5941-AbhemC和空表达载体pFGC5941转入烟草中,经PCR检测得到转基因阳性植株。RT-qPCR检测发现转干扰载体的烟草(Ri)hemC基因表达量显著低于阴性对照组(CK)和阳性对照组(P)。对组培和温室培养期间的烟草叶色进行观察对比发现,Ri组烟草叶色总体偏黄,为黄绿色,两个对照组烟草叶色几乎都是蓝绿。对转基因烟草的叶绿素含量及相关前体物质含量分析表明,Ri组烟草叶绿素a、b及总叶绿素含量均显著低于两个对照组,说明Ri组烟草叶绿素合成受阻。且Ri组烟草叶绿素合成前体物质ALA和PBG含量与两个对照组没有显著差异,而UroⅢ含量和PBGD酶活性都显著低于对照组,说明hemC基因是叶绿素生物合成的关键基因,hemC基因表达受抑,降低了 PBGD酶的活性,导致叶绿素的合成受阻,叶片黄化。4、2个AbhemC基因的原核表达分别构建的2个AbhemC的原核表达重组质粒pET15b-AbhemC1、2并导入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,获得纯化蛋白。对诱导表达的2个目的蛋白活性进行测定,发现AbHEMC1和AbHEMC2都能检测到PBGD酶活性,其活性无显著差异。
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