论文部分内容阅读
目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV-2）糖蛋白gD、gB、gC和早期表达蛋白ICP 27的多表位复合DNA疫苗和免疫佐剂IL2质粒，以及在复合疫苗质粒基础上修饰的信号肽质粒与泛素化质粒，并探讨其诱导小鼠机体免疫应答的能力。方法国内HSV-2野生株经PCR鉴定后利用PCR技术从其基因组中扩增出HSV-2 ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282、gD1-77六个基因片段，PCR鉴定后按先后顺序，采用多基因片段一步酶切连接法获得HV融合基因片段，经pGEMT载体克隆后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1载体中，构建出重组真核表达质粒HV-pcDNA3.1，并对其进行酶切分析及测序鉴定。PCR扩增gD146-179信号肽片段，进一步酶切连接构建重组质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1，并对其进行酶切分析及测序鉴定。PCR扩增人基因组DNA和HSV-2基因组中泛素全长基因和HSV-2 ICP27 377-459，酶切连接获得融合基因片段，插入真核表达质粒pcDNA3.1载体中，构建出重组质粒Ub-ICP-pcDNA3.1，并对其进行酶切分析及测序鉴定。PCR扩增人IL-2信号肽基因和人IL-2尾段基因，取上述两段PCR扩增产物作为融合PCR的模板，扩增IL-2 cDNA全长基因，连入pcDNA3.1质粒中，构建出重组质粒IL-2-pcDNA3.1，并对其进行酶切分析及测序鉴定。C57／BL6雌性6周龄小鼠40只，随机分为8组，每组均5只，根据免疫的质粒类型和免疫方式的不同，各组依次为pcDNA3.1（空质粒对照）、HV-pcDNA3.1、HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1、gDs-HV-his-pcDNA3.1、gDs-HV-his-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1、Ub-ICP-pcDNA3.1和HV-pcDNA3.1、HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1。免疫前先用特异性抗原刺激，前6组小鼠每只用5ug的相应质粒（与IL2共表达的组用5+5ug的量）和1ug的脂质体充分混合，20min后转染到同批次C57／BL6雌性鼠脾淋巴细胞中，37℃、5％CO2培养4h后注射入小鼠皮下；后2组小鼠也用5ug的相应质粒（与IL2共表达的组用5+5ug的量）直接注射到双侧胫骨前肌中。14天后正式免疫，前6组小鼠每只用100ug的相应质粒（与IL2共表达的组用100+100ug的量）和10ug的脂质体充分混合，20min后注入小鼠双侧胫骨前肌中；后2组小鼠也用100ug的相应质粒（与IL2共表达的组用100+100ug的量）直接注入小鼠双侧胫骨前肌中。14天后再加强免疫一次，方法和剂量与正式免疫完全一致。加强免疫后3周小鼠断尾取血，分离血清。断颈处死小鼠取脾，分离淋巴细胞。ELISA检测小鼠血清HSV-2特异性IgG、IL-2和IFN-γ，MTT法检测小鼠脾T淋巴细胞特异性增殖，乳酸脱氢酶法检测杀伤性T淋巴细胞（CTL）功能和流式细胞仪检测CD4+／CD8+T细胞亚群分类。结果构建的HV-pcDNA3.1质粒、IL2-pcDNA3.1质粒、Ub-ICP-pcDNA3.1质粒、gDs-HV-his-pcDNA3.1质粒经酶切鉴定并进行DNA测序，测序结果正确，表明已成功构建出HSV-2多表位复合DNA疫苗。免疫小鼠后实验结果显示：gDs-HV-his-pcDNA3.1与IL2-pcDNA3.1联合免疫后体液免疫最强，特异性IgG效价达到400倍左右；T细胞表面信号分子CD4的阳性率与空载体pcDNA3.1组相比有显著差异（P＜0.05）。而HV-pcDNA3.1与IL2-pcDNA3.1联合免疫后细胞免疫水平最强，特异性T淋巴细胞的刺激指数SI达到2.75左右，而空质粒对照组为0.7左右；淋巴细胞杀伤实验CTL反应的杀伤率（效靶比为50：1时）接近50％，而空质粒对照组为8％左右；T细胞表面信号分子CD8的阳性率与空载体pcDNA3.1组相比也有显著差异（P＜0.05），但CD4+／CD8+的值无显著差异（P＞0.05）；血清中细胞因子IL2和IFN-γ含量检测结果显示：IL2水平（ng／L）为1421.16±220.98，而空质粒对照组为685.21±104.20；IFN-γ水平（ng／L）为1956.19±219.60，而空质粒对照组为547.71±189.33。另一组有关不同免疫方式比较的实验总体上看则说明了脂质体包裹的DNA疫苗比单纯的裸DNA注射法能显著提高免疫活性，若用脂质体包裹起来同时转染IL2质粒和复合疫苗质粒则更强。结论1．成功构建了HSV-2多表位复合DNA疫苗，包括质粒HV-pcDNA3.1、信号肽质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1、泛素化质粒Ub-ICP-pcDNA3.1和佐剂质粒IL2-pcDNA3.1。2．小鼠动物实验表明，我们构建的疫苗质粒HV-pcDNA3.1和信号肽质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1能有效诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答，与佐剂质粒IL2-pcDNA3.1共同免疫效果更强。信号肽质粒gDs-HV-his-pcDNA3.1与佐剂质粒IL2-pcDNA3.1共注射诱导的体液免疫反应最强，而质粒HV-pcDNA3.1与佐剂质粒IL2-pcDNA3.1共注射诱导的细胞免疫反应最强。3．质粒经脂质体包裹并在免疫前通过淋巴细胞体外转染小鼠皮下预注射方法比单纯裸质粒注射方法能明显提高体液免疫和细胞免疫反应。4．泛素化质粒Ub-ICP-pcDNA3.1不能诱导有效的体液免疫和细胞免疫应答。