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血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)为临床常用抗高血压药物之一,其可通过减少血管紧张素II(Ang II)的生成和抑制缓激肽(BK)的降解而发挥降压作用,然而却可能存在咳嗽、味觉功能紊乱、皮疹及白细胞减少等副作用。食源性ACE抑制肽具有作用温和、安全性高且对正常人群血压无影响等特点而备受关注。雄黑豆为豆科植物大豆(Glycine max(L.)merr)的黑色种子,常用于治疗头晕目悬、阴虚烦渴、水肿尿少等。醋豆是以整粒黑豆为原料,经食醋制渍而成,为民间常用降压验方。黑豆中蛋白质含量高达36～40%,其多肽具有ACE抑制活性,且具有易消化吸收性和高溶解性等特点,因此我们推测多肽组分可能是醋豆降压的重要药效物质基础之一。然而醋制对黑豆蛋白含量与组成及多肽ACE抑制活性的影响尚未有详细报道。本论文以雄黑豆为研究对象,考察醋制对其蛋白含量与组成及多肽ACE抑制活性的影响,筛选适宜蛋白组分。通过酶解法获得ACE抑制肽,然后采用超滤(UF)、离子交换色谱(IEC)及反相高效液相色谱(RP-HPLC)法进行分离纯化,并采用液质联用技术(HPLC-ESI-MS/MS)对高活性组分进行氨基酸序列鉴定。所获多肽序列采用分子模拟技术进行虚拟筛选和结构优化,最终获得高活性ACE抑制肽并进行体内外降压活性评价。雄黑豆主要成分研究。采用微量凯氏定氮法、索氏提取法、旋光法、烘干法、马弗炉法分别测定雄黑豆蛋白质、粗脂肪、淀粉、水分、灰分含量。结果显示:黑豆蛋白质含量最高,占其鲜重的46.74 ± 0.22%,粗脂肪、淀粉、水分和灰分含量分别为 19.70±0.08%、15.96±0.83%、6.67±0.01%和 4.45±0.01%。可见,黑豆蛋白质含量丰富,其酶解后所获生物肽组分具有较大研究价值。醋制对雄黑豆蛋白含量和蛋白组分相对比例的影响研究。分别对黑豆进行7 d和14d醋制,采用顺序抽提法依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四类蛋白质组分,并采用微量凯氏定氮法进行定量。结果显示:经醋制后,黑豆总蛋白含量变化幅度≤ 0.5%(46.73 ± 0.22%(0 d),47.22 ± 0.62%(7 d),46.41 ±0.23%(14 d)),而各蛋白组分的含量发生了较大变化,总体变化趋势为:经醋制后,清蛋白含量降低,而球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白含量增加,且14 d醋豆谷蛋白含量最高,占总蛋白的59.45%。其中,清蛋白含量由25.76%(0d)下降至4.46%(14 d);醋制0 d、7 d和14 d谷蛋白含量分别为9.87%、27.56%和27.59%。醋制对雄黑豆多肽ACE抑制活性的影响研究。采用胃蛋白酶水解四类蛋白质组分,经超滤(MWCC=3KD)获得小分子肽(≤3KD)组分,体外ACE抑制活性测定结果显示:经醋制7 d后,清蛋白及醇溶蛋白多肽活性无显著变化,而醋制14d后,清蛋白多肽活性由21.09%(7d)降低至6.11%(14d),醇溶蛋白多肽活性由30.05%(7 d)增加至35.85%(14 d);球蛋白多肽活性不受醋制时间的影响;谷蛋白多肽活性随醋制时间延长而增加,由18.18%(0d)增加至37.58%(14 d)。因此,选择14 d醋豆谷蛋白作为制备ACE抑制肽的最佳蛋白源。醋豆谷蛋白源ACE抑制肽的制备工艺研究。采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶及碱性蛋白酶分别水解14d醋豆谷蛋白,经超滤(MWCO=3KD)获得小分子肽(≤3 KD)组分,经测定,碱性蛋白酶水解所得肽组分活性最高,在终浓度为0.01 mg/mL时ACE抑制率为47.47%。以水解度及ACE抑制活性为考察指标,确定了碱性蛋白酶对醋豆谷蛋白的水解条件为:底物浓度[S]=2%,酶与底物比[S]/[E]=1:10,温度60℃,水解时间4h。ACE抑制肽的分离纯化。采用卷式超滤膜(MWCO= 3 KD)大规模超滤谷蛋白酶解物,获得小分子肽(≤3 KD)组分,在终浓度为0.01 mg/mL下的ACE抑制率为44.16 ± 0.45%;采用阴离子交换色谱对小分子肽(≤3 KD)组分进行分离,共获得L1～L4四个组分,其ACE抑制率分别为68.81 ± 1.51%、27.50 ±0.73%、30.57 ± 0.99%和 14.50 ± 0.32%;采用 RP-HPLC 法对 L1 组分进行分离纯化,获得7个组分(L1-1～L1-7),其中,L1-2组分活性最低,其抑制率为15.37±0.73%,而L1-4组分活性最高,其抑制率为83.41 ±0.91%;采用液质联用技术(HPLC-ESI-MS/MS)对L1-4组分进行序列鉴定,通过搜索Uniprot数据库鉴定出 5 条多肽(CD001-CD005)。所鉴定多肽的活性预测及结构优化。将5条多肽分别进行ACE药效团匹配和分子对接(3种ACE蛋白受体模型:1086、4BZR、4CA5)研究。其中,CD002-CD005四条序列与药效团模型匹配,FitValue值分别为0.96、0.96、0.92、0.95;CD001 与 4BZR 对接成功,CD002 与 4BZR、1086、4CA5 均对接成功,CD003与4BZR对接成功。综合分析药效团匹配及分子对接结果,预测CD002和CD003可能具有较高的ACE抑制活性。采用Peptide Cutter软件对CD002和CD003进行计算机模拟胃肠道水解,最终获得具有较高活性潜力的多肽CD003-1,其ACE药效团匹配值为0.96,与受体蛋白1086、4BZR和4CA5对接的-CDOCKER_ENERGY值分别为134.79、121.88和97.20,化学合成后,经测定其 IC50 值为 117.11 μM。多肽CD003-1的体内降压活性研究。以自发性高血压大鼠(SHR)为研究载体,设定空白对照组(蒸馏水)、阳性对照组(15mg/kg卡托普利)、CD003-1低剂量组(10mg/kg)、CD003-1中剂量组(20mg/kg)及CD003-1高剂量组(40 mg/kg),考察多肽CD003-1的体内降压活性。结果表明:低剂量组、中剂量组和高剂量组单次灌胃给药后SHR血压最大下降值分别为10.41 mmHg、21.95 mmHg和33.58 mmHg。其中,中剂量组的降压效果与15 mg/kg卡托普利阳性对照组效果相当(23.00mmHg),且降压作用可持续8h,表明多肽CD003-1具有显著的降压效果。本研究从醋豆谷蛋白中获得了具有显著体内外降压活性的多肽CD003-1,该序列有望成为降压药物的先导化合物。本研究也从多肽角度为醋豆降压功效的研究提供了新的思路。