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第一部分：miR-181b通过调节白色脂肪细胞中内皮细胞功能提高葡萄糖稳态和胰岛素敏感性目的：胰岛素抵抗的病理过程涉及基因表达的失调和包括内皮细胞在内的多种细胞功能的改变。小核糖核苷酸(micro ribonucleic acid, miRNA)的转录后调控能够影响基因表达,调节内皮细胞功能进而影响胰岛素效用。本实验中,我们将观察miR-181b在肥胖过程中是否能够通过白色脂肪组织的内皮细胞来调节内皮功能进而影响胰岛素抵抗的病理进程。方法和结果：miR-181b在肥胖小鼠脂肪组织的内皮细胞中表达减少；外源性给予miR-181b能够提高葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。尾静脉注射niR-181b后,miR-181b能够在脂肪组织内皮细胞中富集,增强胰岛素介导的Akt磷酸化,减少内皮失能,促进白色脂肪组织中巨噬细胞向抗炎表型M2转换。这些效果伴随着内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和叉头转录因子01亚型(forkhead box O1, FoxO1)磷酸化增加,内脏脂肪细胞中一氧化氮(nitric oxide, NO)活性提高。相反的,miR-181b不影响肝脏和骨骼肌中胰岛素刺激引起的Akt磷酸化。生物信息学和基因谱分析发现,PH结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白质磷酸酶2(PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatases isoform 2, PHLPP2),一种能在丝氨酸473位点(serine 473, Ser473)去Akt磷酸化的磷酸酶,是miR-181b的新靶点。降低PHLPP2水平能够增加内皮细胞Akt磷酸化(Ser473),并重复miR-181b在体内对葡萄糖稳态、胰岛素敏感性和内脏脂肪细胞炎症的作用。最后,糖尿病患者的内皮细胞中,PHLPP2表达水平增加。结论：我们的数据揭示了脂肪组织内皮细胞在胰岛素抵抗中的重要作用。外源性给予miR-181b或PHLPP2抑制剂有希望通过提高脂肪组织内皮细胞Akt-eNOS-NO信号来减弱胰岛素抵抗。第二部分：miR-181b靶向Card10抑制凝血酶介导的内皮活化和动脉血栓目的：促凝和炎症介质如凝血酶能够引起核因子κ-基因结合蛋白(nuclear factor-κ-gene binding, NF-κB)介导的内皮活化和失能,这在动脉血栓中发挥了很大作用。本实验将探讨抗炎的miR-181b能否在动脉血栓中发挥作用。方法和结果：内皮细胞中过表达miR-181b能够通过减少NF-κB激酶抑制剂β(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,β, IKK-β)和NF-κB抑制剂a(NF-kappa-B inhibitor alpha, IκB-α)的磷酸化和p65的核转位来抑制凝血酶激活的NF-κB信号通路。miR-181b也能够减少NF-κB的靶基因如血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1, ICAM-1)、E选择素(E-selectin, E-sel)和组织因子(tissue factor, TF)等的表达。机制上,miR-181b能够靶向半胱天冬酶招募域家族10(caspase recruitment domain family, member 10, Card10); Card10是一种接头蛋白,能够连接来自胞外并经蛋白酶活化受体1(Protease-activated receptor 1, PAR-1)传导的刺激信号和下游的rNF-κB激酶抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase, IKK)复合物。miR-181b能够减少Card10基因和蛋白的表达；不影响PAR-1的表达。miR-181b能够抑制Card103’端非翻译区(3’-Untranslated Regions,3’UTR)荧光素酶报告基因活性；小核糖核蛋白-免疫沉淀反应(micro-ribonucleoprotein immunoprecipitation, miRNP-IP)实验表明RNA诱导的沉默复合物中Card10的表达增加了4倍。抑制Card10后,能够复制miR-181b对凝血酶引起的NF-κB通路和靶基因的作用。有意思的是,Card10抑制对肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-a, TNF-a)介导的NF-κB通路和靶基因没有作用；这预示着niR-181b在内皮细胞中能够刺激特异性地调节NF-κB通路和靶基因。最后,在光化学损伤诱导的动脉血栓模型中,过表达miR-181b能够减少颈动脉中73%的血栓形成,并延长血栓形成的时间。结论：miR-181b在凝血酶诱导的内皮活化和动脉血栓模型中起重要作用。过表达miR-181b或给予Card10抑制剂可通过提高血管内皮的功能而改善动脉血栓,未来可能成为一种新的治疗选择。