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成体干细胞的多向分化和自我更新是组织器官再生修复的基础，然而此生物学特性易受体内炎症微环境的影响。喉黏膜间充质干细胞（laryngeal mucosa mesenchymalstem cells，LM-MSCs）是分离培养喉黏膜获得的间充质干细胞，因其与声带均发育于中胚层，且同属于喉部结构，故用于修复声带组织损伤具有巨大潜能。本课题组前期分离、培养和鉴定了LM-MSCs，并将其注射至激光损伤的声带，分别于2w、4w和8w观察声带组织修复情况，实验证实，LM-MSCs用于声带修复可以有效的减轻声带水肿、瘢痕的形成，且细胞可在体内存活长达8w以上，并可向肌成纤维细胞转化，表明LM-MSCs可有效修复声带损伤。然而，在临床手术切除声带病变组织的同时也会引起声带急性炎症的形成。急性炎症对LM-MSCs生物学特性的影响势必将会影响LM-MSCs修复组织损伤的功能。Wnt信号通路是人体生长、发育过程中重要的信号通路，其在多种疾病发生、发展过程中发挥重要的作用。Wnt信号通路主要可分为决定细胞命运的经典Wnt/β-catenin信号通路和与组织极性及细胞运动密切相关的非经典通路。其中，有研究表明Wnt/β--catenin信号通路参与了正常及炎症微环境下细胞增殖、分化能力的调控。在炎症微环境牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）成骨分化能力下降，用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂DKK1下调通路，可部分或全部逆转PDLSCs的成骨分化能力。综上，我们在体外模拟炎症微环境并探讨其对LM-MSCs成脂、成骨和成肌多向分化能力的影响，考虑声带组织的特殊性，我们重点研究炎症微环境对LM-MSCs成肌分化能力的影响。并用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂或激活剂调控通路，以期恢复炎症微环境中LM-MSCs的成肌分化能力。研究目的：探讨炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力如成骨、成脂及成肌分化能力的影响，揭示炎症条件下Wnt/β-catenin的变化作用规律，通过在Wnt/β-catenin信号通路分子水平上进行调控，以期恢复炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力，最终促进LM-MSCs修复声带组织损伤及组织再生。研究方法：1. LM-MSCs分离培养、鉴定与多向分化能力的研究：用消化法分离培养会厌舌面黏膜组织获得LM-MSCs，流式细胞仪检测干细胞表面标志物CD105，CD90，CD44，CD34，CD14和CD31表达情况；将细胞向成骨诱导分化21d后行茜素红染色，鉴定其成骨分化能力；将细胞向成脂细胞方向诱导分化14d后行油红O染色，鉴定其成脂分化能力；将细胞向成肌细胞方向诱导分化1w、3w和6w后，行免疫荧光化学染色和实时定量检测（RT-PCR）检测其成肌分化能力。2.炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力的影响：用10ng/ml的TNF-α和5ng/ml的IL-1β在体外模拟炎症微环境，将细胞在炎症和正常微环境分别向成骨、成脂和成肌方向诱导分化，在成骨诱导分化后的7d和21d分别行碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色，并将生成的矿化结节溶解下来行定量检测；在成脂诱导分化14d行油红O染色，并将脂滴溶解下来行定量检测；在成肌诱导分化的1w、3w和6w提取细胞蛋白和基因，用RT-PCR和Western Blot蛋白印迹检测技术检测成肌初始基因和蛋白Myod1、成肌分化标志性基因和蛋白Myogenin（Myog）和成肌分化终末基因和蛋白myosin heavy chain（MyHc）表达情况；并检测Wnt/β-catenin信号通路中重要的信号分子GSK3β、P-GSK3β和β-catenin蛋白和基因表达情况，以检测Wnt/β-catenin信号通路在炎症微环境LM-MSCs成肌分化过程中所处的状态。3. Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控：体外实验中，分别用DKK1下调炎症微环境和Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化过程中Wnt/β-catenin信号通路，并检测成肌分化相关蛋白和基因表达情况；按体外实验分组情况制备成肌分化的细胞胶原团块，并将其移植至裸鼠皮下2w，取出移植物，行HE染色观察组织学行为，Masson三色染色和观察细胞成肌分化情况，行免疫荧光化学染色观察成肌分化相关蛋白表达情况。结果：1. LM-MSCs分离培养、鉴定与多向分化能力的研究：用消化法分离培养会厌舌面黏膜组织，可获得LM-MSCs，其可贴壁生长，呈长梭形，阳性表达间充质干细胞表面分子标志CD105（94.2%），CD90（99.5%）和CD44（99.8%），不表达造血系和内皮细胞系干细胞表面标志物CD34(0.6%)，CD14(0.7%)和CD31(0.5%)。细胞经成骨诱导分化21d并行茜素红染色，可见细胞中有矿化结节着红色；细胞经成脂诱导分化14d后并经油红O染色后，可见细胞中串珠样脂滴红染；将细胞向成肌细胞方向诱导分化1w、3w和6w后，行免疫荧光化学染色和RT-PCR检测成肌相关基因和蛋白表达情况，可见初始基因和蛋白Myod1和成肌分化特异性标志蛋白和基因Myog于成肌诱导分化后1w开始表达，并可持续表达于成肌诱导分化6w，成肌分化终末标志蛋白和基因MyHc于成肌诱导分化3w时表达，持续表达于成肌诱导分化6w。2.炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力的影响2.1炎症微环境对LM-MSCs成骨分化能力影响：炎症和正常微环境中将LM-MSCs向成骨细胞诱导分化，并分别行ALP染色、茜素红染色，结果可见，细胞在炎症和正常微环境中成骨诱导分化7d后ALP染色均可着蓝染，而炎症微环境下细胞着色浅；成骨诱导分化21d后行茜素红染色，可见炎症微环境下细胞着红染色矿化结节少于正常微环境，表明炎症微环境抑制LM-MSCs骨向分化。2.2炎症微环境对LM-MSCs成脂分化能力影响：炎症和正常微环境中将细LM-MSCs向成脂细胞诱导分化，并于诱导分化14d后行油红O染色，炎症和正常微环境LM-MSCs脂向分化过程中均有脂滴生成，而炎症微环境中串珠样脂滴形成较少，表明炎症微环境抑制LM-MSCs脂向分化。2.3炎症微环境对LM-MSCs成肌分化能力影响：炎症和正常微环境中将LM-MSCs向成肌细胞诱导分化，并分别于诱导分化后1w、3w和6w提取细胞基因和蛋白，行RT-PCR和Western Blot检测成肌相关蛋白和基因，可见炎症微环境中LM-MSCs肌向分化过程中成肌分化相关蛋白和基因均较对照组表达量降低。3. Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控3.1体外实验：分别用DKK1下调炎症微环境和Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化过程中Wnt/β-catenin信号通路，并检测成肌分化相关蛋白和基因表达情况，可见经DKK1干预后炎症微环境中LM-MSCs成肌相关蛋白和基因表达量较炎症组增高，加入Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化，可见成肌相关蛋白和基因表达量与炎症组都较正常减弱，表明下调Wnt/β-catenin信号通路可逆转炎症微环境对LM-MSCs成肌分化的抑制作用，而上调通路则可抑制正常微环境中LM-MSCs的成肌分化。3.2体内实验：按体外实验分组情况制备成肌分化的细胞胶原团块，并将其移植至裸鼠皮下2w，取出移植物，行HE染色观察组织学行为，Masson三色染色和观察细胞成肌分化情况，行免疫荧光化学染色观察成肌分化相关蛋白表达情况，其结果与体外实验结果一致，表明下调Wnt/β-catenin信号通路可逆转炎症微环境对LM-MSCs成肌分化的抑制作用，而上调通路则可抑制正常微环境中LM-MSCs的成肌分化。结论1炎症微环境对LM-MSCs成骨分化能力影响：LM-MSCs属于间充质干细胞，具有向成骨、成脂及成肌细胞方向分化的能力。2炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力的影响：炎症微环境对LM-MSCs成骨、成脂及成肌细胞分化均具有抑制作用。3Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控：通过下调Wnt/β-catenin信号通路可一定程度逆转炎症微环境对LM-MSCs肌向分化能力的抑制作用。