目的:由于血脑屏障的存在,药物经常规途径如口服给药后在脑内的浓度较低,限制了对脑部疾病的治疗。鼻腔在生理解剖上与脑具有天然的联系,使鼻腔给药成为有效治疗脑部疾病的一种潜在新途径。在很多情况下可以作为注射给药的替代途径,非常适用于急救、自救。目前,常用的鼻腔制剂评价模型多采用牛、羊、猪等大型动物的鼻腔黏膜,均存在一定的种属差异性,且所需给药剂量较大,因而不适用于药物的早期筛选。细胞模型可以从细胞、分子水平评估药物的黏膜渗透特点,适用于药物有效成分的吸收,特别是中药复方制剂的吸收机制研究。因此,本论文建立了原代人鼻黏膜上皮细胞和血脑屏障细胞模型,对醒脑静处方中芳香开窍药促进水溶性成分栀子苷经鼻入脑的转运方式及其作用机制进行了研究。方法:选用醒脑静处方中的水溶性有效成分栀子苷为指标,以原代人鼻黏膜上皮细胞模型研究栀子苷及其复方配伍在鼻-脑通路的转运;以MDCK、MDCK-MDR1细胞系研究栀子苷及其复方配伍经鼻入血,跨血脑屏障入脑的转运过程。通过分子生物学技术,如细胞紧密连接蛋白分布、细胞膜流动性、Na+/K+-ATP酶活性、细胞膜电位和细胞内钙离子等,研究方中开窍药艾片、麝香促进栀子提取物经鼻入脑转运的作用机制。鼻黏膜吸收促进剂被认为普遍存在黏膜毒性,芳香开窍药具有较强的脂溶性,多具辛香走窜之性,因此在研究其促进药物吸收的同时,选用黏蛋白基因(MUC5AC、5B和8 mRNAs)和炎症细胞因子IL-8 mRNA为指标,对其可能引起的毒性反应进行研究。结果:(1)鼻黏膜上皮细胞和血脑屏障细胞模型的建立。我们采用酶消化法分离得到鼻黏膜上皮细胞,使用改良的消化法,得到大量的鼻黏膜单细胞和许多鼻黏膜组织小碎片,先将其进行常规传代培养,在得到一定数量细胞后,再以特异性免疫磁珠法,对目的细胞(鼻黏膜上皮细胞)进行纯化,最终可以得到99%以上纯度细胞。经过筛选得到含有细胞添加因子培养基,BEGM和BEGM:DMEM/F12(1:1)培养基有对HNEC细胞生长有明显促进作用。扫描电镜观察所获得的鼻黏膜上皮细胞纤毛分化良好,形态和功能与体内类似,且操作简便、高效、重复性好。实验建立了较为稳定的MDCK、MDCK-MDR1细胞培养和传代方法,细胞间连接紧密,彼此相嵌排列,透明度较高,折光性强,细胞生长状态良好。(2)醒脑静所含药物的细胞毒性实验。栀子苷在0-400 μg·mL-1、艾片在0-200 μg·mL-1、麝香酮在0-40 μg·mL-1、艾片与栀子苷配伍组(栀子苷:艾片=0.9:1)以艾片量计在0-150 μg·mL-1、麝香酮与栀子苷配伍组(栀子苷:麝香酮=6:1)以麝香酮量计在0-30μg·mL-1、艾片麝香酮栀子苷配伍组(栀子苷:艾片:麝香酮=0.9:1:0.15)以艾片量计在0-150 μg·mL-1浓度范围内对HNEC、MDCK、及MDCK-MDR1细胞均没有毒性。在相同药物浓度条件下,栀子苷的细胞毒性明显小于艾片和麝香酮,三者中麝香酮的毒性最大。(3)栀子苷单独及其与开窍药配伍后的单层细胞跨膜转运实验研究。不同浓度的栀子苷(25、50、100 μg·mL-1)在HNEC、MDCK、MDCK-MDR1单层细胞模型上吸收和外排速率相比较无显著性差异,栀子苷的吸收速率不受药物浓度的影响,同时外排率Re均小于2,提示栀子苷的跨膜转运方式为被动扩散,无主动转运过程。栀子苷在HNEC吸收和外排方向的表观渗透系数在1 ×106cm·s-1至10×10-6 cm·s-1范围内,具有中等透过吸收速率;在MDCK、MDCK-MDR1单层细胞模型上吸收和外排方向的表观滲透系数均小于1×10-6 cm·s-1,较难透过细胞膜,与栀子苷水溶性性质相符,在三种单层细胞模型上吸收和外排的途径,主要通过细胞间隙孔道进行转运。按照醒脑静处方组成,与开窍药艾片、麝香酮配伍后,栀子苷的转运速率较单独给药有所增大,高剂量配伍具有显著性差异。(4)栀子苷配伍开窍药在单层细胞模型跨膜转运的作用机理研究。艾片、麝香酮可以使给药部位细胞间的紧密连接暂时疏松,加速药物通过。它们主要可以引起骨架蛋白actin结构的改变,细胞膜及胞核周边肌动蛋白丝带模糊、部分断裂,细胞间连接松散,出现细胞间裂隙,促进栀子苷经细胞旁路吸收;还可以作用于细胞膜的脂质,增加细胞膜脂质的流动性,降低膜的黏度,从而增加栀子苷穿细胞途径的转运吸收。艾片、麝香酮可以使细胞膜电位去极化程度增加,进而可以降低细胞膜的黏滞性,提高细胞膜流动性,增强物质通透性;此外,还可以调节细胞内钙离子浓度促进细胞收缩并相互分离,促进栀子苷经细胞旁路转运吸收。栀子苷的跨膜转运不消耗ATP能量,艾片、麝香酮能够提高Na+,K+-ATP ase、Ca2+-ATP ase活性,提示其可能对于一些主动载体转运的药物具有促进吸收作用。(5)栀子苷配伍艾片、麝香酮作用HNEC细胞24h后,可以引起细胞中MUC5AC、MUC5B和MUC8 mRNA表达量的增加,随着药物剂量的增加表现出作用增强的趋势,配伍高剂量组的表达量是对照组的2-4倍;艾片、麝香酮对炎症细胞因子IL-8 mRNA表达量也具有增加作用,配伍高剂量组是对照组的2-2.5倍。我们采用Elisa法测定了栀子苷配伍艾片、麝香酮作用HNEC细胞24 h后上清液中黏蛋白和细胞因子的表达,结果与PCR一致。可以得出,艾片、麝香酮可能引起正常鼻腔黏蛋白的分泌增加,并导致炎症因子释放增加,引起一定的炎症反应,提示其对鼻黏膜具有一定的刺激性,且麝香酮的刺激作用较艾片强。结论:艾片麝香酮具有芳香开窍作用,其作用机制可能与打开细胞紧密连接、增强细胞膜的流动性和Na+,K+-ATP酶,Ca2+-ATP酶活性、降低细胞膜电位以及调节细胞内钙离子浓度等有关。艾片、麝香酮对鼻黏膜具有一定的刺激性,要注意控制给药浓度和选择合适的药物剂型。