杜仲胶颗粒糖组分的鉴定及功能研究

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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)不仅是全球极具开发潜能的天然胶源树种,也是我国十分重要的中药材、木本油料和战略资源树种。杜仲叶片、翅果皮及树皮中均含有杜仲橡胶(Eucommia rubber,Eu R),它是巴西橡胶(natural rubber,NR)的同分异构体,分子结构为反式-1,4-聚异戊二烯(trans-1,4-polyisoprene,TPI)。因为杜仲胶是由杜仲含胶细胞所产生的一种次生代谢物,在含胶细胞的整个生长发育过程中,形成杜仲胶生物合成的特化细胞器橡胶颗粒。解析杜仲胶颗粒的组成及变化规律,对于揭示杜仲胶合成机制具有重要意义。本研究以不同月份杜仲叶为材料,分析各时期杜仲叶片橡胶颗粒中糖脂和杜仲胶分子量的动态变化规律,为阐明杜仲胶颗粒的功能提供理论依据,主要取得以下结果:1、杜仲胶颗粒形态特征观察对不同月份(6-11月份)杜仲叶片中所提取纯化的杜仲胶颗粒显微观察发现,杜仲胶颗粒呈圆形或椭圆形,并且随着叶片的发育成熟,胶颗粒粒径大小也在逐渐变化,其粒径大小在1-13μm之间不等,且其平均粒径大小随着杜仲叶片发育的成熟也逐渐增大,在9月份达到最大值,虽在10、11月份有所下降,但差异不显著,总体上其粒径大小呈先增加后稳定的变化趋势;另外,发现小杜仲胶颗粒(<5μm)和大胶颗粒(>5μm)的平均粒径也也随着月份的增加而增加;此外,不同大小杜仲胶颗粒的百分比组成显示,小杜仲胶颗粒的比例从6月的65.91%下降到11月的19.09%,而大杜仲胶颗粒的比例从6月的34.09%上升到11月的80.91%。说明,随着月份的增加,杜仲胶颗粒的粒径也在逐渐增大,在粒径增加的同时,同样会有新的胶颗粒在不断的形成。2、杜仲胶颗粒糖脂组成分析利用UPLC-Orbitrap质谱系统对8-11月份杜仲胶颗粒中糖脂组分进行检测,共检测到6大类糖脂,包括双半乳糖二酰甘油(DGDG)、双半乳糖单酰甘油(DGMG)、单半乳糖双酰甘油(MGDG)、单半乳糖单酰甘油(MGMG)、硫代异鼠李糖二酰甘油(SQDG)和硫代异鼠李糖单酰甘油(SQMG),且每个大亚类糖脂中又含有不同种的糖脂分子;DGDG、DGMG分别含有49种、7种,MGDG、MGMG分别含有2种和28种,SQDG含有44种,SQMG含有10种糖脂分子。此外这6大类糖脂组分的表达量在不同月份叶片胶颗粒中表现出显著差异性(P<0.05),其中以SQDG的含量最高,在11月份时达2.15×1010。另外,研究还发现随着杜仲叶龄的增加,杜仲胶颗粒中DGMG和MGDG变化呈先降后增趋势,而SQDG和SQMG呈先增后降的变化趋势。进一步对同一月份所检测到的不同糖脂的含量分析发现,无论在哪个月SQDG的含量都是最大的,且均显著高于其它糖脂含量,含量最低的糖脂为MGMG,但与DGMG、SQMG差异不显著。说明,杜仲叶片的橡胶颗粒中所含糖脂中,SQDG极为重要,可能影响杜仲胶颗粒的形态大小。3、糖脂与杜仲胶分子量相关性分析通过对7-11月份杜仲叶中杜仲胶颗粒内部杜仲胶分子量测定表明,除7、8月份检测出6个特异性分子量分布峰外,其余各月份均只检测出3个特异性分子量分布峰,其中,杜仲胶高分子量平均分子量((?)),以9月份的最高,达37.40×10~4,8月最低,仅为22.30×10~4,且显著低于9月份(P<0.05);而低分子量平均分子量((?)),7月份最小,但与8月份差异不显著(P>0.05),为0.06×10~4,10月份最大,为0.1×10~4;平均重均相对分子量((?))7月份最小,为1.40×10~4,9月份的((?))最高达1.77×10~4,但8-11月份差异不显著(P>0.05);平均数均相对分子量((?))10月份最小,但与11月份差异不显著,为0.27×10~4,8月份最大,为0.69×10~4;杜仲果胶颗粒内部橡胶相对分子量分布(D=Mw/Mn)比叶片宽,7月份最小,但与8月份差异不显著,为2.31×10~4,10月份最大,为6.05×10~4,表明7、8月份杜仲胶颗粒中不同大小分子量的胶分子含量较多,但橡胶相对分子量分布较为集中,而9、10和11月份胶颗粒中不同大小分子量的胶分子量含量较少,却分布较分散。采用SPSS 26.0对不同月份杜仲胶分子量及胶颗粒糖脂相对含量进行相关性分析,发现不同月份糖脂组成的显著差异对杜仲胶平均分子量大小影响不大,但对个别杜仲胶分布峰中的平均分子量大小有一定影响,推测SQDG的高表达会引起了高分子量杜仲胶分子的合成,SQMG的表达也参与影响低分子量杜仲胶和平均数均分子量的生物合成,SQDG和SQMG共同影响了平均重均分子量,进而影响了杜仲胶的相对平均分子量分布。4、糖脂合成相关基因表达分析通过荧光定量PCR测得糖脂DGDG、SQDG合成相关的相关基因DGD1、UGP3在杜仲叶、茎、果中的表达量,发现DGD1、UGP3在8-11月份杜仲叶中的变化趋势与利用UPLC-Orbitrap质谱系统对8-11月叶片杜仲胶颗粒脂膜糖脂组分测定的结果相一致,进一步证明了DGD1在糖脂成分DGDG合成中起到关键作用和UGP3在糖脂成分SQDG合成中起到关键作用,也为进一步研究DGDG和SQDG在8-11月杜仲茎及翅果中杜仲胶颗粒脂膜上糖脂表达的变化提供一定参考,且UGP3的高表达可能影响杜仲胶颗粒粒径大小。
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