【摘 要】
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本文将含有canstatin-N基因的质粒pPIC9K-CN线性化后,电激法转化毕赤酵母GS115,获得his+阳性转化子,将阳性转化子点种到具不同G418浓度(1000,2000,3000 ug/mL)的YPD平板上,并用
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本文将含有canstatin-N基因的质粒pPIC9K-CN线性化后,电激法转化毕赤酵母GS115,获得his+阳性转化子,将阳性转化子点种到具不同G418浓度(1000,2000,3000 ug/mL)的YPD平板上,并用线性化诱导型质粒pPIC9K-CN再次转化在含3000 ug/mL G418的YPD平板上挑选的抗性菌株,在含4000 ug/mLG418的YPD平板上挑选出高G418抗性转化子。PCR结果表明canstatin-N基因已整合到毕赤酵母GS115(pPIC9K-CN)染色体上。对转化子进行诱导表达,Tricine SDS-PAGE电泳显示,GS115(pPIC9K-CN)经甲醇诱导后在10 kDa附近出现一条新的蛋白带,而转化了pPIC9K空载体的GS115的泳道上没有这条蛋白带,表明canstatin-N基因可能已在毕赤酵母转化子中获得诱导型表达。采用摇瓶发酵方法,对GS115(pPIC9K-CN)的表达条件,即起始甲醇浓度及发酵时间进行了研究,确定了最适起始甲醇浓度为3%,30℃诱导72 h后,表达量约为25 mg/L。将表达上清经过超滤浓缩除盐后,采用StreamLine SP阳离子交换柱进行纯化,上柱条件为:pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液体系作为上样缓冲液,以0.15mol/L的NaCl溶液为洗脱液。最后,分别用CAM法和MTT法检测纯化产物的生物活性。在CAM试验中,cantatin-N抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管的形成,其作用呈剂量依赖性。
本文还构建了组成型表达质粒pGAP9K-CN,将其线性化后电激法转化毕赤酵母GS115,获得his+阳性转化子,经G418抗性筛选,在含3000 ug/mL G418的YPD平板上挑选出高G418抗性转化子用于摇瓶发酵。
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