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研究背景癌症极大地危害着人类的生命健康,化学药物治疗仍是目前肿瘤治疗的主要手段。而肿瘤针对性较强的化学药物治疗将成为肿瘤治疗的主攻方向。结肠癌是高发病率且高死亡率的恶性肿瘤之一,找到一种有效、作用特异的化学治疗药物是非常必要的。PTEN是一新发现的抑癌基因,与多种肿瘤的发生发展关系密切,但其确切的作用机制以及作用信号通路仍在研究之中。研究发现,PTEN在结肠癌的形成及致癌过程中起着关键的作用。化合物5-[2,3-二氯-4-(2-亚甲基-1-代丁基)氯苯]-3-甲基-1,2,4-嗯二唑(6r)是含有噁二唑基团的依他尼酸(EA)的衍生物。前期研究表明,6r能在体外、体内抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡,例如6r能有效的抑制人前列腺癌、骨髓性白血病、人宫颈癌、结肠癌等,提示其具有较好的抗肿瘤活性。本课题选4种不同的人结肠癌细胞株,深入探讨化合物6r抑制人结肠癌增殖的作用机制及其抗增殖作用与人结肠癌细胞中PTEN表达水平的相关性。实验方法首先,采用MTT法检测6r对4种人结肠癌细胞HT2、SW620、HCT116和Lovo生长的抑制作用。Western blotting法检测4种细胞内PTEN的表达水平及6r对PTEN表达水平的影响。其次,考察化合物6r对PTEN介导的信号通路的影响。采用FITC-AnnexinV/PI双染法检测6r对HT29和HCT116细胞的凋亡诱导作用；碘化丙啶(P1)单染法检测6r对HT29和HCT116细胞周期的影响。划痕试检测6r对HT29细胞迁移能力的影响。Western blotting法检测6r对HT29、SW620和HCT116细胞中PI3K、P-AKT、MDM2及P53蛋白表达水平的影响。最后,观察PTEN抑制剂VO-OHpic是否能抑制6r对PTEN介导的下游信号通路的影响及对结肠癌细胞生长的抑制作用。采用MTT法检测VO-OHpic存在时6r对HT29和HCT116细胞生长的抑制作用。台盼蓝染色法检测在VO-OHpic作用下6r对HT29和HCT116细胞的毒性作用。Western blotting法检测在VO-OHpic作用下6r对HT29和HCT116细胞内P-AKT和P53蛋白表达的影响。实验结果1化合物6r对结肠癌细胞的抗癌效应与PTEN有关MTT结果显示,6r对3种结肠癌细胞HCT116、HT29和SW620的增殖具有较强的抑制作用,对Lovo细胞抑制作用较弱。Western blotting结果显示在无6r存在时,HCT116、HT29、SW620和Lovo细胞中PTEN的表达水平依次降低；而在化合物6r作用下,HCT116、HT29、SW620和Lovo四种细胞中PTEN蛋白的表达水平明显增加,且具有剂量依赖性。26r通过激活PTEN介导的下游通路抑制结肠癌的生长FITC-AnnexinV/PI双染法试验结果显示,2、4、6μM三个浓度的6r处理HT29和HCT116细胞48h,细胞凋亡率逐渐增加。PI单染法试验结果显示,2、4、6μM6r处理HT29和HCT116细胞48h,处于S期的细胞数比例显著增加,证明6r可阻滞HT29和HCT116细胞周期于S期。划痕试验结果显示,4、6μM6r分别处理HT29细胞12、24、36、48h,在36、48h时能显著抑制细胞迁移率。Western blotting结果显示,6r可显著下调HT29和HCT116细胞中pro-casepase-3和pro-casepase-9蛋白的表达,上调Bax/Bcl-2的比例；显著下调HCT116、HT29和SW620中PI3K、P-AKT和MDM2蛋白的表达,上调P53蛋白的表达。3VO-OHpic抑制PTEN介导的信号通路,降低6r抗肿瘤作用MTT及台盼蓝染色试验均显示,在抑制剂VO-OHpic (500nM)存在时,6r (6μM)对HT29和HCT116细胞生长的抑制作用明显减弱,与单用6r(6μM)组相比有显著性差异。Western blotting结果显示,单用6r组HT29和HCT116细胞中P-AKT蛋白表达显著下调,P53蛋白表达明显上调。6r(6μM)与抑制剂VO-OHpic (500nM)共同孵育后,6r对P-AKT蛋白和P53蛋白表达的调节作用明显被抑制。结果表明PTEN抑制剂VO-Ohpic能拮抗6r的抗肿瘤增殖作用。结论6r对结肠癌的抑制作用强弱与结肠癌细胞中PTEN的表达水平密切相关。6r通过上调PTEN表达,激活PTEN下游通路,从而诱导细胞凋亡,产生较强的抗结肠癌作用。