目的：环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)作为细胞内重要的第二信使调节多种细胞功能。磷酸二酯酶-4(PDE4)特异性水解cAMP,调节细胞内cAMP水平。随着对PDE4认识的加深,抑制PDE4进而升高细胞内cAMP水平在记忆的巩固和强化中有举足轻重的影响。本课题的目的在于通过不同的动物模型明确抑制PDE4是否可以缓解或改善以认知障碍为主要临床特征的Alzheimer’s病(Alzheimer’s Disease, AD)的记忆缺失;利用基因敲除和基因敲减技术确定PDE4家族(PDE4A-D)中哪一个亚型对AD中的记忆调节起着更为重要的作用。首先,基于大鼠AD动物模型探讨PDE4选择性抑制剂咯利普兰对大鼠认知行为的影响及海马pCREB蛋白表达的变化,以明确PDE4是否参与AD学习记忆障碍的调节过程。其次,利用基因敲除PDE4亚型PDE4D的方法证实PDE4D在AD小鼠模型中对认知缺陷是否有影响,以明确PDE4D亚型在记忆强化中的作用。冉次,利用RNA干扰技术进一步阐明PDE4D4和PDE4D5亚亚型能否逆转AD大鼠的记忆力损害。因此,本课题从不同层面研究PDE4和亚型的功能及其在认知障碍疾病中的调节作用。鉴于PDE4抑制剂咯利普兰致呕吐的不良反应,我们利用小鼠呕吐替代模型(即alpha2肾上腺素能受体介导麻醉时间)评价抑制PDE4亚型或亚亚型所产生的潜在呕吐反应的强弱,明确单一抑制某种亚型是否可以降低致吐不良反应的发生,为开发高选择性、不良反应较少的高效亚型抑制剂提供理论依据。方法：(1)以大鼠脑内微量注射淀粉样蛋白功能片段Aβ25-35(20 nmol/侧)造成AD记忆障碍模型,给予PDE4抑制剂咯利普兰(0.5 mg/kg)反复(14 d)腹腔注射后,用Morris水迷宫(包括靶向获得性试验和空间探索试验两部分)和被动回避实验分别检测动物的空间记忆能力和对不可逃避性伤害刺激的记忆,并用Western blotting检测大鼠海马pCREB的蛋白表达水平。(2)在PDE4D基因敲除小鼠海马内微量注射Aβ42(0.4μg/侧),两周之后用物体识别、跳台回避以及水迷宫分别测试动物对新物体的识别记忆、被动回避记忆和空间位置定向记忆能力。(3)利用RNA干扰技术构建含PDE4亚亚型PDE4D4/5-MicroRNAs(miRNAs)的病毒载体,将病毒注入AD大鼠海马区,一周后观察大鼠在八臂迷宫的工作记忆和参考记忆,以及避暗实验中的被动回避记忆,并用放射免疫法分析海马和皮层总PDE、非PDE4及PDE4活性。此外,还用Western blotting检测皮层和海马pCREB的表达水平,以分析行为学变化与cAMP第二信使下游的靶蛋白表达之间的关系。(4)利用氯胺酮和塞拉嗪联合麻醉小鼠,记录不同基因型或不同处理的动物翻正反射恢复的时间,从而间接评价抑制PDE4或其亚型产生的潜在致吐不良反应的强弱。结果：(1)反复注射PDE4抑制剂咯利普兰能够改善AD大鼠在水迷宫的行为学,表现为海马注射Aβ25-35之后10天,大鼠在水迷宫靶向获得性试验中需要更长的时间(与对照组相比)才能找到平台,而咯利普兰处理的大鼠寻找平台的时间缩短；而且,在探索性实验(移去平台)中,经咯利普兰干预的AD大鼠在目标象限(即曾经放置平台的象限)空间探索的时间延长。这种强化的空间记忆保留时间至少有一周。大鼠在水迷宫的行为表现与其游泳速度无关,排除了动物一般活动行为的影响。在被动回避实验中,AD大鼠在明箱停留时间较短,咯利普兰处理大鼠则停留时间较长,对暗箱不可逃避的电刺激有较牢固的记忆。这些认知行为的改善和海马pCREB的增高密切相关。(2)PDE4D基因敲除小鼠在一系列学习记忆测试模型中均表现出比野生型对照鼠有更好的记忆。在物体识别试验中,基因敲除小鼠对新物体有更长时间的识别；注射Aβ42的PDE4D基因敲除鼠并没有表现出明显的认知障碍。在跳台回避试验中,PDE4D基因缺失能够对抗Aβ42导致的停留时间缩短,表明PDE4D缺失能够改善AD小鼠的学习记忆损害。此外,水迷宫探索性试验证实,PDE4D基因敲除小鼠在一定时间内更频繁地穿越目标象限,表明动物缺失PDE4D基因有更好的空间记忆。(3)大鼠海马注射微量Aβ42一周之后,在八臂迷宫的工作记忆和参考记忆错误频率比其对照组增加,这是Aβ42损伤海马依赖型空间记忆所致。用miRNAs干扰PDE4D4/5基因表达可以减少工作记忆的错误频率；这种作用可持续12天。酶活性测定结果表明PDE4D4/5基因敲减导致总PDE和PDE4活性不同程度的下降,即是PDE4D4/5基因表达下调不同程度的影响酶活性。Aβ42损伤海马记忆的同时,也降低海马pCREB蛋白量的表达；PDE4D4/5-miRNAs可以恢复海马pCREB的表达,而不同的处理对皮层pCREB的表达没有影响。(4)氯胺酮和噻拉嗪联合诱导小鼠麻醉,翻正反射消失。野生型小鼠平均需要一小时的时间恢复翻正反射,咯利普兰则使翻正反射恢复时间缩短,这与该药的致呕吐特性一致。PDE4D敲除小鼠只需要野生型小鼠一半的时间就能从麻醉状态苏醒过来。注射PDE4D4/5-miRNAs的小鼠比PDE4D基因缺失小鼠需要更长的时间恢复翻正反射,与野生型对照组无明显差别。结论：PDE4家族作为调节cAMP水平的重要水解酶参与学习记忆的调节。不管是存正常动物还是认知障碍动物模型上,抑制PDE4均可改善认知、增强记忆。在AD大鼠模型上,我们证实了长期给予PDE4选择性抑制剂咯利普兰增强动物空间学习记忆,且维持时间较长。咯利普兰不仅改善AD动物的认知,而且增加海马pCREB的表达。在PDE4家族成员繁多(4种亚型,至少25种亚亚型)又缺乏亚型特异性抑制剂的情况下,我们采用基因敲除手段确认了PDE4D为四种亚型(PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D)中与学习记忆关系较密切的一个PDE4亚型,这尤其体现在PDE4D基因缺失逆转Aβ42引起的小鼠多种记忆障碍,包括空间记忆、识别记忆和伤害性刺激记忆。此外,用RNA干扰技术证明,PDE4D4/5亚亚型参与AD的记忆调节,下调PDE4的两种亚亚型PDE4D4/5基因表达缓解Aβ42造成的空间记忆损伤,这两种亚型可能在海马依赖型记忆形成和巩固中起重要作用。最后,通过评价不同处理或不同基因型动物对氯胺酮和噻拉嗪联合诱导麻醉后翻正反射恢复的时间发现,抑制PDE4D4/5亚亚型延长翻正反射恢复需要的时间,可能不会产生呕吐反应。这些结果为治疗AD等神经退行性疾病引起的记忆障碍提供了新的靶点,有望通过抑制PDE4D亚型或PDE4D4/5亚亚型来对抗AD学习记忆障碍,同时为阐明PDE4亚型的记忆调节作用提供了可靠的实验依据,也为开发PDE4亚型抑制剂提供了理论基础。