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研究背景宫颈癌是严重危害我国妇女健康的恶性肿瘤之一。宫颈癌的复发和转移是患者治疗失败的主要原因。上皮细胞向间质细胞的转变即上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)在宫颈癌的发生和发展发挥着重要作用[1,2]。EMT以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征,为上皮细胞获得迁移能力的最主要的方式。脱嘌呤/脱嘧啶内切核酸酶1(APE1)不仅能修复DNA的损伤还具有氧化还原活性,激活许多转录因子,在FIGO分期较高、分化越低、存在淋巴结转移的患者APE1表达增高[3],提示APE1参与了宫颈癌的进展。EMT作为肿瘤转移的重要机制之一,研究证实在非小细胞肺癌中APE1参与调控了EMT[4],然而在宫颈癌中APE1是否调控EMT及其调控的具体分子机制尚不完全清楚。因此本研究拟利用特异性抑制剂和基因敲除细胞株,通过运用蛋白功能位点突变、CO-IP、凝胶迁移电泳(EMSA)和免疫荧光以及裸鼠成瘤等技术,深入研究APE1在宫颈癌EMT中具体分子机制,对进一步阐明宫颈癌侵袭转移的机理以及今后可能的靶点干预具有重要的的科学意义。免疫治疗不仅在其它肿瘤治疗中有着显著的疗效,同样在宫颈癌中也显示出了光明的前景。程序性死亡配体-1(PD-L1)为B7家族的一个成员,是由抗原呈递细胞表达,具有抑制T淋巴细胞激活的功能。PD-L1通过与其受体结合,诱导T淋巴细胞无反应性和/或凋亡[5-8]。前期相关研究发现APE1与PD-L1在表达上存在相关性,且分别与肿瘤的转移存在关联[9-12]。然而在宫颈癌中,至今尚未有文献系统详细报道早期宫颈癌中APE1和PD-L1的表达与年龄、淋巴结转移和预后之间的关系。本研究中检测了PD-L1和APE1在早期宫颈鳞癌组织中的表达情况,分析了两者之间相关性及其临床意义,为APE1与PD-L1可能存在的相互调控机制的研究提供临床依据。研究目的1.明确APE1是否参与调控宫颈癌EMT,探索APE1参与宫颈癌EMT的具体分子机制。2.探讨早期宫颈鳞癌中APE1与PD-L1表达相关性以及与临床病理因素的相关性。研究内容和方法1.APE1及其氧化还原功能对宫颈癌EMT的影响:以APE1 SiRNA干扰宫颈癌细胞株APE1表达以及APE1稳定敲低型、氧化还原功能缺陷型细胞为研究对象,利用Western blot、免疫荧光、transwell实验、划痕实验以及裸鼠实验观察APE1及其氧化还原功能对宫颈癌EMT的影响。2.APE1与ZEB1相互作用的机制研究:利用HA标签的APE1真核质粒以及FLAG标签的ZEB1真核质粒、APE1 Si RNA以及APE1 redox功能抑制剂E3330等,运用免疫共沉淀的方法双向验证APE1与ZEB1相互结合,利用电泳迁移实验(EMSA)揭示APE1及其氧化还原功能可影响ZEB1与目的基因的结合能力,影响目的基因E-cadherin的表达。3.APE1与PD-L1在早期宫颈鳞癌中的表达相关性及临床意义:收集64例FIGO分期为I期或IIa期的并行手术治疗的早期宫颈鳞癌患者临床资料、随访信息以及手术组织标本。免疫组化染色APE1与PD-L1抗体,SPSS22.0统计软件分析,APE1与PD-L1表达与临床特征关系使用卡方检验,Spearman等级相关分析APE1与PD-L1表达相关性,患者生存时间使用Kaplan-Meier法分析,多因素采用Cox回归评估各临床病理参数对预后的相对危险度。研究结果1.宫颈癌中APE1氧化还原功能调控ZEB1介导的EMT:APE1及其氧化还原功能可促进EMT的发生,增强了宫颈癌细胞的转移能力,并且APE1与ZEB1可形成蛋白复合物,APE1的氧化还原功能并不调控ZEB1的表达,而是影响ZEB1的转录活性进而影响目的基因E-cadherin的表达。2.APE1与PD-L1在早期宫颈鳞癌中表达具有相关性且与宫颈癌的进展有关:早期宫颈癌患者APE1和PD-L1蛋白表达阳性率分别为70.31%和67.18%。PD-L1的表达与分期、淋巴结转移有显著相关性(P<0.05),而APE1的表达仅与淋巴结转移密切相关(P=0.038)。另外,APE1与PD-L1的表达正相关(r2=0.347,P=0.005),且两者共表达与淋巴结转移相关,其术后生存期比单一阳性表达的宫颈癌患者明显缩短(P<0.05)。多因素COX回归模型结果显示,APE1的表达和淋巴结转移是影响早期宫颈鳞癌预后的独立危险因素,危险度分别为16.187(P=0.01)和27.340(P<0.001)。研究结论1.宫颈癌中双功能蛋白APE1通过与ZEB1相互结合进而调控ZEB1的转录活性,降低E-cadherin的表达,促进宫颈癌EMT发生,该过程调控依赖于APE1氧化还原功能。2.在早期宫颈鳞癌中APE1与PD-L1表达具有相关性,两者均高表达时早期宫颈鳞癌患者预后较差,APE1与PD-L1在早期宫颈鳞癌的进展中发挥了一定的作用。APE1与PD-L1的表达联合检测对早期宫颈鳞癌预后的评估具有潜在价值。