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研究一 大鼠骨癌痛模型的建立及酸感受离子通道(ASIC)亚基的表达目的通过建立大鼠骨癌痛模型并研究其背根神经节(DRG)上ASIC亚基mRNA和蛋白质的表达变化,来探索ASIC亚基在骨癌痛发生发展中的作用。方法Sprague-Dawley大鼠45只随机分为三组：假手术组(sham, n=15),骨癌痛模型7天组(C7,n=15),骨癌痛模型14天组(C14,n=15)。三组大鼠分别于左后肢胫骨上段髓腔内注射5μL生理盐水(sham组)或1×104/μL walker256鼠源性乳腺癌细胞生理盐水悬浮液(C7组和C14组),建立癌痛模型。术后密切观察大鼠健康状况，用Von Frey filament(VFF)细丝和CO2激光热刺激仪测量大鼠左下肢机械痛敏缩足阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和热痛敏PWT的变化。分别于术后7天和14天对大鼠进行行microCT影像学检查和HE病理学检查,以确定肿瘤对胫骨的破坏情况。在各组观察期结束时,分别取腰4、腰5(L4、L5)DRG。RT-PCR,免疫印迹和免疫荧光分别用来检测DRG上ASIC的mRNA和蛋白质的表达变化。结果与sham组大鼠相比,C7、C14术侧下肢机械痛敏PWT和热痛敏PWT明显下降(P<0.01)。Micro CT图像表明,C7组胫骨破坏不明显,C14组有明显的骨质破坏,甚至有骨皮质的缺损。与假手术组相比较,在六个ASIC亚基中,只有C14组同侧的ASIC3亚基的：mRNA表达升高(P<0.05)。但是在蛋白表达方面,除了ASIC2a,同侧的ASIC1, ASIC3, ASIC4亚基蛋白都不同程度的表达升高(P<0.01)。免疫双标的方法检测到与假手术组相比较,C14组手术中ASIC3和异凝集素-B4(IB4)共表达的神经元的数目更多。另外,我们也发现与假手术组相比较,C14组中ASIC3和neurofilament 200 (NF200)共同表达的DRG神经元更多。结论大鼠胫骨内注射Walker256细胞可以成功复制骨癌痛模型。大鼠脊髓左侧L4、L5 DRG上ASIC3的mRNA和蛋白质的表达量明显增高,提示ASIC3亚基可能在骨癌痛的发生发展中有一定作用。组同侧的ASIC3亚基的：mRNA表达升高(P<0.05)。但是在蛋白表达方面,除了ASIC2a,同侧的ASIC1, ASIC3, ASIC4亚基蛋白都不同程度的表达升高(P<0.01)。免疫双标的方法检测到与假手术组相比较,C14组手术中ASIC3和异凝集素-B4(IB4)共表达的神经元的数目更多。另外,我们也发现与假手术组相比较,C14组中ASIC3和neurofilament 200 (NF200)共同表达的DRG神经元更多。结论大鼠胫骨内注射Walker256细胞可以成功复制骨癌痛模型。大鼠脊髓左侧L4、L5 DRG上ASIC3的mRNA和蛋白质的表达量明显增高,提示ASIC3亚基可能在骨癌痛的发生发展中有一定作用。研究二SDF-1及其下游信号通路对于Nav1.8电流的调节作用目的趋化因子作为一种新的神经调质参与脊髓水平和脊髓上水平的疼痛感知过程。Stromal cell-derived factor 1 (SDF-1),又名chemokine CXC motif ligand 12(CXCL12),在慢性疼痛模型动物的背根神经节(DRG)上的表达升高。但是SDF-1对于河豚毒素不敏感(TTXR)内通道Nav1.8电流变化的作用机制尚未得到研究。本文就是利用电生理学的方法研究SDF-1及其受体CXCR4对于Navl.8钠离子通道的调控作用。方法免疫荧光的方法用来检测Nav1.8和CXCR4在DRG神经元上的共分布。急性分离培养的DRG神经元和不同浓度的SDF-1 (5,25,50,200,400 ng/mL)进行孵育1-2小时。全细胞电压钳记录空白对照组和不同浓度SDF-1孵育组DRG神经元上的Nav1.8电流的变化,以观察SDF-1对Navl.8电流的影响。随后,全细胞电压钳技术记录CXCR4受体抑制剂AMD3100、G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)和霍乱毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对于Nav1.8电流的影响。结果利用免疫荧光的方法,实验发现42%的DRG神经元是CXCR4蛋白和Nav1.8钠离子通道蛋白共同表达的。SDF-1预处理急性分离的小直径的DRG神经元,会记录到神经元上Nav1.8电流幅度呈现SDF-1浓度依赖性的增高。SDF-1也使得Nav1.8电流的稳态激活曲线向超极化的方向发展。实验中所用的抑制剂(AMD3100,PTX, CTX, LY294002)都会不同程度的增加Nav1.8电流。另外用这些抑制剂预处理背根神经节也会使Nav1.8的稳态激活曲线向着超极化的方向转移。结论SDF-1可以增加Nav1.8电流来兴奋初级伤害性感受神经元,但是SDF-1对Nav1.8的调节可能并不是通过CXCR4及其下游的G蛋白和PI3K信号通路。离子通道蛋白共同表达的。SDF-1预处理急性分离的小直径的DRG神经元,会记录到神经元上Nav1.8电流幅度呈现SDF-1浓度依赖性的增高。SDF-1也使得Nav1.8电流的稳态激活曲线向超极化的方向发展。实验中所用的抑制剂(AMD3100,PTX, CTX, LY294002)都会不同程度的增加Nav1.8电流。另外用这些抑制剂预处理背根神经节也会使Nav1.8的稳态激活曲线向着超极化的方向转移。结论SDF-1可以增加Nav1.8电流来兴奋初级伤害性感受神经元,但是SDF-1对Nav1.8的调节可能并不是通过CXCR4及其下游的G蛋白和PI3K信号通路。研究三SDF-1及其下游信号通路对于Nav1.9电流的调节作用目的研究表明趋化因子是小分子蛋白的细胞因子超家族,它们在免疫和神经调节中发挥重要的作用。Stromal cell-derived factor 1(SDF-1),又名chemokine CXC motif ligand 12(CXCL12),在慢性疼痛模型动物的背根神经节(DRG)上的表达升高。但是SDF-1引起TTXR钠离子电流Nav1.9电流发生变化的机制尚未得到研究。本实验利用电生理学的方法研究SDF-1及其受体CXCR4对于Nav1.9钠离子通道的调控作用。方法免疫荧光的方法用来检测Nav1.9和CXCR4在DRG神经元上的共表达。急性分离的DRG神经元和不同浓度的SDF-1(5,25,50,200,400 ng/mL)进行孵育1-2小时。全细胞电压钳记录空白对照组和SDF-1孵育组DRG神经元上的Nav1.9电流的变化,以观察SDF-1对Nav1.9电流的影响。同时,全细胞电压钳技术也记录了CXCR4受体抑制剂AMD3100、G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)和霍乱毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对于Navl.9电流的影响。结果利用免疫荧光的方法,实验中发现37%的DRG神经元是CXCR4蛋白和Nav1.9钠离子通道蛋白共同表达的。研究中我们也发现,SDF-1预处理急性分离的小直径DRG神经元,可以记录到神经元上Nav1.9电流幅度呈现SDF-1浓度依赖性的增高。SDF-1也使得Nav1.9电流的稳态激活曲线向超极化的方向发展。对于Nav1.9通道来说,CXCR4受体抑制剂AMD3100可以阻断SDF-1引起的Nav1.9电流密度和通道动力学特性的改变。PTX而不是CTX可以阻断SDF-1引起的Navl.9电流的增加,这表明Gi/o蛋白亚基参与SDF-1对于Nav1.9钠通道电流的调节。另外,磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002也参与SDF-1对于Nav1.9电流的调节。结论研究表明,SDF-1可能通过作用于Nav1.9电流来兴奋初级伤害性感受神经元。SDF-1通过激活其受体CXCR4及其下游信号通路来调节Nav1.9电流的变化。