论文部分内容阅读
目的:脑胶质瘤侵袭性生长、生长迅速,是成人中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。传统治疗方式效果不理想,临床预后差。研究表明长链非编码RNAs（long noncoding RNAs,LncRNAs）的核苷酸数量通常大于200个,在发生发育和疾病发展中起着重要的作用,研究证实其参与调控肿瘤进展,长链非编码RNAs在肿瘤中存在差异性表达,其表达异常与细胞增殖、迁移侵袭能力改变及凋亡等生物学行为异常相关。LINC00657通过DNA损伤诱导产生,故又被称之为DNA损伤激活的长链非编码RNA（non-coding RNA activated by DNA damage,NORAD）。LINC00657在乳腺癌、结直肠癌、食道癌等多种肿瘤中表达增加,表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关,提示其可能作为促癌基因存在,在胶质瘤中LINC00657是否同样发挥促癌作用,目前尚未见报告。MicroRNAs又称小分子RNA（miRNAs）,研究证实miRNAs在多种疾病特别是肿瘤中起重要的调节作用。MiRNAs与lncRNAs之间存在着相互调控关系。MiR-433-3p定位于12号染色体,作为抑癌基因抑制如胆囊癌细胞等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭能力。MiR-203a-3p定位于14号染色体,在胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用。HOX基因编码的蛋白是一类转录因子,含有同源异形域,在多种肿瘤疾病中存在异常表达现象,研究证实HOXD3基因高表达与肺癌、乳腺癌、前列腺癌呈正相关。本研究旨在探讨LINC00657、miR-433-3p、miR-203a-3p、HOXD3对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等行为的调节机制,在胶质瘤的临床治疗方面探讨新的方向。方法:1.内源性表达:应用Real-time PCR技术得出LINC00657、miR-433-3p、miR-203a-3p、HOXD3mRNA的相对表达水平;2.双荧光素酶报告基因检测LINC00657与miR-433-3p、miR-203a-3p、HOXD3与miR-433-3p、miR-203a-3p的结合位点;3.在胶质瘤细胞U251、U87中稳定转染sh-LINC00657及其空白对照、瞬时转染agomir-433-3p、antagomir-433-3p及其各自空白对照,瞬时转染agomir-203a-3p、antagomir-203a-3p及其各自空白对照、HOXD3（+）、sh-HOXD3及其各自空白对照,分别得到相应表达沉默或过表达的胶质瘤细胞;4.胶质瘤细胞增殖力检测:CCK8实验;5.胶质瘤细胞迁移、侵袭力:Transwell实验;6.胶质瘤细胞凋亡力:流式细胞仪;7.HOXD3蛋白表达:Western Blot;8.裸鼠移植瘤实验检测裸鼠移植瘤生长及生存期。结果:1.LINC00657在胶质瘤组织及细胞中高表达,沉默LINC00657的表达显著降低胶质瘤细胞U251、U87的增殖、迁移及侵袭能力,并促进细胞凋亡;2.LINC00657能够靶向结合miR-433-3p及miR-203a-3p,沉默LINC00657表达miR-433-3p及miR-203a-3p表达升高;3.MiR-433-3p及miR-203a-3p在胶质瘤组织及细胞中低表达,过表达miR-433-3p及miR-203a-3p促进细胞凋亡,而细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,并;4.与沉默LINC00657组相比,沉默LINC00657同时过表达miR-433-3p及miR-203a-3p促进细胞凋亡,细胞增殖、迁移及侵袭能力明显降低;5.MiR-433-3p及miR-203a-3p能够分别结合HOXD3的3’UTR区并抑制HOXD3表达;6.在胶质瘤组织及细胞中HOXD3高表达,表达sh-HOXD3的胶质瘤细胞凋亡增加、增殖、迁移及侵袭能力明显下降;7.miR-433-3p或miR-203a-3p过表达联合HOXD3过表达可以逆转miR-433-3p或miR-203a-3p对胶质瘤细胞生物学行为的抑制作用;8.单独以及联合应用沉默LINC00657、过表达miR-433-3p、过表达miR-203a-3p能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长,延长生存时间。结论:1.LINC00657、HOXD3在胶质瘤组织及细胞中高表达,miR-433-3p及miR-203a-3p在胶质瘤组织及细胞中低表达。沉默LINC00657、HOXD3以及过表达miR-433-3p、miR-203a-3p抑制胶质瘤细胞生物学行为,其增殖、迁移及侵袭能力下降,细胞凋亡率上升。2.LINC00657分别靶向结合miR-433-3p、miR-203a-3p,HOXD3是miR-433-3p和miR-203a-3p的靶基因。3.沉默LINC00657的表达能够上调miR-433-3p及miR-203a-3p的表达,进而减弱miR-433-3p及miR-203a-3p对HOXD3的负反馈调节作用,从而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。4.单独以及联合应用沉默LINC00657、过表达miR-433-3p、过表达miR-203a-3p能够显著抑制裸鼠移植瘤的生长,延长裸鼠生存时间。三者联合应用的抑瘤效果最佳。5.LINC00657/miR-433-3p（miR-203a-3p）/HOXD3通路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。