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研究目的1.利用无血清悬浮培养法从三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231分离获得于细胞球,鉴定其肿瘤干细胞特性,观察干细胞形成血管能力。2.检测AURKA蛋白激酶在干细胞球和常规培养细胞的表达,加入AURKA蛋白激酶抑制剂观察对干细胞球成血管能力的影响及c-myc、sox-2、E-cadherirn、 β-catenin的表达变化。3.在裸鼠移植瘤模型中观察AURKA蛋白激酶抑制剂对血管生成拟态及c-myc、 sox-2、E-cadherin、β-catenin表达的影响。研究方法1.常规方法培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并利用无血清悬浮培养法从对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞分离获得干细胞球,RT-PCR检测干细胞转录因子c-myc、sox-2的表达,三维培养观察干细胞球形成血管能力。2. Western blot检测AURKA蛋白激酶在干细胞和常规培养细胞是否存在差异表达,利用干细胞球进行三维培养并加入AURKA蛋白激酶抑制剂观察对成血管能力的影响,RT-PCR检测在加入AURKA蛋白激酶抑制剂后c-myc、sox-2、 E-cadherin、β-catenin的表达变化。3.选取5周龄的BALB/C-nu雌裸鼠20只,将无血清悬浮培养获得的MDA-MB-231干细胞球1×106个接种于裸鼠右侧近前肢的皮肤,10天后瘤体积达到约0.2cm3,按瘤体体积大小分为两组,对照组给予皮下注射10%2-羟丙基-β-环糊精、1%碳酸氢钠(溶解药物的溶剂),实验组给予皮下注射MLN-8237/10%2-羟丙基-β-环糊精/1%碳酸氢钠,每天测量瘤体体积,给药10天后,处死裸鼠,收集移植瘤,4%福尔马林固定。根据每天测得的瘤体体积绘制肿瘤生长曲线,免疫组化染色观察给药组与对照组c-myc、sox-2、 E-cadherin、β-catenin的表达是否存在差异,观察抗肿瘤药物AURKA蛋白激酶抑制剂MLN-8237对肿瘤生长和VM形成的影响。研究结果1.接种于含生长因子无血清培养液中的乳腺癌细胞,24h后在倒置相差显微镜下可见较小的肿瘤干细胞球形成,数量较少,呈类圆形,形状不规则,大小不一,结构松散。培养至10-14d,肿瘤干细胞球数量增多,形成由数十个至上百个细胞组成的成熟细胞球,呈悬浮生长,球体进一步增大,呈圆形或卵圆形,折光性强,细胞连接紧密。人乳腺癌MDA-MB-231细胞经干细胞无血清悬浮培养后,对获得的乳腺癌干细胞球进行RT-PCR检测干细胞转录因子c-myc、sox-2的表达情况。结果显示无血清悬浮培养获得的乳腺癌干细胞球较常规培养细胞高表达干细胞转录因子c-myc、sox-2。2.对无血清悬浮培养获得的乳腺癌干细胞球和常规培养的乳腺癌细胞进行Western blot检(?)AURKA蛋白激酶表达情况。实验结果表明：利用无血清悬浮培养获得的乳腺癌干细胞球中AURKA蛋白激酶表达升高。采用"ongel"三维培养法观察细胞管道形成能力。三维培养48h后可见细胞呈梭状或多边形,伸出细长伪足,细胞相互连接形成大量管腔结构。加入AURKA蛋白激酶抑制剂后可见细胞聚集呈克隆状,形成管腔结构明显减少。对乳腺癌干细胞球和加入AURKA蛋白激酶抑制剂后获得的乳腺癌干细胞球进行RT-PCR检测c-myc、sox-2、 E-cadherin、β-catenin的表达情况。结果显示无血清悬浮培养获得的乳腺癌干细胞球较加入AURKA蛋白激酶抑制剂后乳腺癌干细胞球高表达c-myc、sox-2、 β-catenin, E-cadherin表达情况相反。3.裸鼠体内转移瘤模型实验结果显示给药组肿瘤生长速度显著低于对照组,癌组织内坏死面积较大；c-myc、sox-2、β-catenin在对照组的表达高于给药组,E-cadherin在给药组的表达高于对照组,给药组VM的形成少于对照组。结论1.利用干细胞超低吸附培养板无血清悬浮培养可获得乳腺癌干细胞球,其干细胞转录因子c-myc、sox-2表达高于常规培养细胞。2. AURKA蛋白激酶在乳腺癌干细胞球中较常规培养细胞表达升高,干细胞球三维培养可形成血管管道,加入AURKA蛋白激酶抑制剂后成血管能力减弱。AURKA蛋白激酶抑制剂能抑制c-myc、sox-2、β-catenin在乳腺癌干细胞球的表达,E-cadherin则情况相反。3. AURKA蛋白激酶抑制剂MLN8237能明显抑制人乳腺癌裸鼠体内移植瘤模型移植瘤的生长,抑制VM的形成,提示AURKA蛋白激酶抑制剂有望成为治疗三阴乳腺癌的特异性分子靶向药物。