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背景:慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种涉及多功能造血干细胞的恶性疾病,其主要特征是骨髓/外周血中髓系细胞增殖、由于染色体发生相互易位形成费城染色体和BCR-ABL融合基因阳性。BCR-ABL融合基因编码BCR-ABL融合蛋白的产生,导致CML的发作,其表现出高的酪氨酸激酶活性。因此,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)成为CML治疗的关键性药物,伊马替尼(Imatinib,IM)是第一代酪氨酸激酶抑制剂,被认为是国内外CML治疗最有效药物,然而,近年来发现20%-25%的CML患者在服药期间发生伊马替尼耐药,严重影响了患者治疗效果。目前对于耐药机制的研究有所进展,但是仍未被完全阐明。因此,本研究主要探讨STAT5-ROS通路持续活化引起慢性髓细胞白血病伊马替尼耐药,运用伊马替尼模型,并结合体内研究阐明STAT5-ROS通路在慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药中的作用机制。目的:本文旨在研究STAT5-ROS通路中相关标记物的表达活化,氧化损伤及细胞凋亡水平,治疗应答与差异指标的相关性,深入认识CML的伊马替尼耐药机制,探讨STAT5-ROS通路的作用,寻找多靶点治疗。方法:(1)实验中选取慢性粒细胞白血病细胞株K562为研究对象,采用浓度梯度法诱导伊马替尼耐药细胞株K562/G。(2)不同浓度伊马替尼作用于K562和K562/G细胞株后,利用CCK-8法检测两种细胞株细胞增殖抑制率,检测两种细胞株对伊马替尼的IC50值,计算耐药倍数。(3)采用不同浓度伊马替尼作用两种细胞株一定时间后,经过台盼蓝染色并计数两株细胞株活细胞数量,绘制生长曲线图。(4)通过预实验确定伊马替尼、ROS抑制剂NAC的工作浓度和作用时间,采用流式细胞术方法检测不同浓度的抑制剂作用后对两种细胞株的细胞凋亡诱导情况和ROS水平检测。(5)通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测CML细胞株K562及耐伊马替尼细胞株K562/G中的STAT5A,STAT5B及内参GAPGH的m RNA水平。(6)Western blot法分析相关通路信号分子蛋白水平,检测两种细胞株STAT5的表达水平及STAT5磷酸化表达水平的变化。(7)收集40例不同治疗时间慢性粒细胞白血病病人及20例正常对照组外周血,提取细胞内总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测细胞内BCR-ABL和STAT5A、STAT5B的m RNA水平。(8)K562和K562/G两种细胞株内JAK2蛋白和细胞因子IL3、IL4、IL6和GM-CSF的比较。(9)P53信号通路途径的变化,检测P53、Bax、Bcl-2 m RNA的变化。结果:(1)建立稳定的伊马替尼耐药细胞株K562/G,CCK-8法检测出两者的耐药倍数为80倍。(2)不同浓度梯度的伊马替尼作用于K562细胞后,经过细胞计数结果显示此浓度梯度的伊马替尼全部抑制K562细胞的生长,24 h细胞活力减低很明显,甚至为零。同样的方法,K562/G细胞在IM浓度低于10umol/L组细胞生长良好,在96 h时活细胞数量与0 h活细胞数量差别不显著。从高于10umol/L浓度起,随IM浓度递增,活细胞数量递减,说明K562/G细胞对伊马替尼有明显的耐药性。(3)与K562细胞比较,其耐药细胞株K562/G对不同浓度的伊马替尼细胞凋亡水平明显下降;K562/G细胞内活性氧ROS水平显著升高(P<0.05)。(4)K562/G细胞STAT5A和STAT5B m RNA表达水平明显高于K562细胞(P<0.05)。(5)与K562细胞相比,K562/G细胞中STAT5和STAT5磷酸化蛋白水平明显升高(P<0.05)。(6)CML病人STAT5A和STAT5B表达水平明显高于正常对照组(P<0.05),CML病人发生耐药组STAT5A和STAT5B表达水平明显高于CML非耐药组(P<0.05)。(7)两种细胞株内JAK2蛋白表达没有变化,但是细胞因子IL3、IL4、IL6和GM-CSF有明显差异(P<0.05)。(8)两种细胞株内P53和Bcl-2差异明显,有统计学意义(P<0.05)。结论:CML病人的STAT5通常处于高激活状态,BCR/ABL作用于STAT5,诱导ROS产生,导致DNA氧化损伤,增加细胞突变,引起CML伊马替尼耐药。STAT5-ROS通路上下游标志物的研究为慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药提供新思路,为探索多靶点治疗提供科学依据。