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目的:探讨Ruxolitinib对JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤细胞内基质金属蛋白酶调控的影响。观察Ruxolitinib对人红白血病HEL细胞(JAK2V617F突变阳性)增殖、凋亡、迁移及JAK2、MMP-2、MMP-9基因、蛋白表达水平的影响。探讨Ruxolitinib对HEL细胞是否存在抑制增殖、迁移,诱导凋亡作用,以及对骨髓增殖性肿瘤原代细胞及HEL细胞抑制JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白、基因表达的作用,为Ruxolitinib应用于临床治疗骨髓增殖性肿瘤提供理论依据。方法:1临床资料:保定市第一医院在2012年1月至2015年12月收治的40例初诊JAK2V617F突变阳性(排除MPLW515K/L及CALR突变)的MPN患者纳入研究(MPN组),男18例、女22例,中位年龄59(34~72)岁,真性红细胞增多症(PV)13例,原发性血小板增多症(ET)10例,原发性骨髓纤维化PMF 17例,以15名健康志愿者作为对照组,其中男8名、女7名,中位年龄55(36~78)岁。所选取的患者诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[1],患者均签署了知情同意。本研究得到保定市第一医院伦理委员会的批准。2基础细胞实验分组选用人红白血病HEL细胞株(JAK2V617F突变阳性)。实验分为:Ruxolitinib处理组、对照组。对照组以含10%新生牛血清的RPMI1640培养基培养。Ruxolitinib处理组以含有不同浓度的Ruxolitinib 10%新生牛血清RPMI1640培养基培养。Ruxolitinib的终浓度分别为(0 nmol/L,50nmol/L,100 nmol/L,250 nmol/L,500 nmol/L,1000 nmol/L)。3应用实时荧光定量PCR检测MPN患者JAK2V617F突变量、MMP-2、MMP-9的m RNA表达。4采用免疫组化检测患者骨髓病理组织p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白的表达。5 Cell Counting Kit(CCK-8)方法,检测Ruxolitinib作用后HEL细胞增殖抑制情况。6流式细胞术,检测18例MPN Ruxolitinib作用24h后细胞CD34+表达的影响。7 Transwell小室实验,检测Ruxolitinib作用24h后MPN细胞、HEL细胞迁移的影响8采用蛋白印迹(Western blot)技术检测Ruxolitinib作用于MPN细胞、HEL细胞后,各组细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白的表达情况。结果:1应用荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR,q PCR)检测MPN患者JAK2V617F突变量在26.8%-75.4%之间。Ruxolitinib对HEL细胞JAK2、MMP-2、MMP-9基因m RNA表达的影响:不同浓度(0nmol/l,50 nmol/l,100 nmol/l,250 nmol/l,500 nmol/l,1000 nmol/L)Ruxolitinib处理HEL细胞48 h后,JAK2基因表达分别为(0.431±0.043)、(0.362±0.032)、(0.254±0.031)、(0.181±0.022)、(0.143±0.022)、(0.143±0.022);MMP-2基因表达分别为(0.397±0.031)、(0.362±0.030)、(0.235±0.023)、(0.188±0.018)、(0.155±0.010)、(0.098±0.009);MMP-9基因表达分别为(0.321±0.032)、(0.252±0.025)、(0.245±0.024)、(0.215±0.025)、(0.155±0.018)、(0.098±0.009)。JAK2、MMP-2、MMP-9 m RNA表达水平均随Ruxolitinib浓度的增加而逐渐减低(P<0.001)。2免疫组织化学检测结果显示:MPN组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达均高于对照组[(78.56±24.55)%对(41.59±17.29)%、(48.25±18.74)%对(22.79±13.89)%、(53.29±19.28)%对(15.56±14.96)%,P值均<0.05]。Spearman相关分析显示MMP-2、MMP-9蛋白水平与JAK2V617F突变量正相关(r=0.526,P<0.05;r=0.543,P<0.05)]。3 CCK-8结果显示:不同浓度(0nmol/l,50 nmol/l,100 nmol/l,250nmol/l,500 nmol/l,1000 nmol/L)Ruxolitinib处理组HEL细胞的存活率,24h时分别为(76.10±3.09)%、(66.04±3.14)%、(60.06±2.71)%、(59.27±2.86)%、(57.86±2.32)%;48h时分别为(70.14±3.39)%、(59.71±3.34)%、(52.80±2.61)%、(43.30±2.96)%(38.56±2.15)%;72h时分别为(55.83±3.43)%、(47.63±3.12)%、(36.43±2.98)%、(31.05±2.78)%、(14.48±2.86)%。与空白对照组相比,不同浓度Ruxolitinib在作用HEL细胞不同时间(24h、48h、72h)后,HEL细胞的活力明显受到抑制,差别有统计学意义(P<0.05)。延长Ruxolitinib作用的时间和增加药物的剂量,细胞活力亦显著减低(P<0.05)。4 Ruxolitinib对JAK2V617F阳性MPN患者骨髓CD34+细胞影响:18例初诊MPN患者中CD34+细胞比例高于对照组[(0.29±0.13)%对(0.23±0.05)%,t=0.286,P<0.001],250 nmol/L Ruxolitinib干预组MPN患者CD34+细胞水平较低于未干预组[(0.29±0.13)%对(0.14±0.07)%,P<0.001]。PV(5例)、ET(6例)、PMF(7例)患者250 nmol/L Ruxolitinib干预组CD34+细胞表达均低于未干预组[(0.18±0.05)对(0.26±0.05)、(0.19±0.04)对(0.25±0.05)、(0.14±0.08)对(0.35±0.08),P值均<0.05]。5 Transwell迁移实验观察Ruxolitinib对MPN原代细胞及HEL细胞迁移的影响:5 nmol/L Ruxolitinib作用MPN原代细胞24 h后迁移至下室细胞数少于无Ruxolitinib的空白组(154.7±27.5对320.3±67.3,t=13.47,P<0.01)。5 nmol/L Ruxolitinib处理HEL细胞24 h后迁移至下室细胞数少于无Ruxolitinib对照组(70.7±10.5对135.3±16.7,t=13.89,P<0.01)。6 Western blot检测显示:Ruxolitnib作用于HEL细胞48h后,空白对照组不同浓度(0nmol/l,50 nmol/l,100 nmol/l,250 nmol/l,500 nmol/l,1000nmol/L)Ruxolitnib作用后HEL细胞检测p-JAK2蛋白相对表达(条带的相对灰度比值)分别为(1.52±0.12)、(1.21.±0.10)、(1.12±0.09)、(0.98±0.07)、(0.45±0.04)、(0.15±0.01)。MMP-2蛋白相对表达分别为(0.53±0.04)、(0.42±0.03)、(0.31±0.03)、(0.27±0.02)、(0.23±0.01)、(0.19±0.01)。MMP-9蛋白相对表达分别为(0.78±0.06)、(0.65±0.04)、(0.54±0.04)、(0.30±0.02)、(0.27±0.02)、(0.23±0.01)。β-actin蛋白的表达在三组中无显著差异。Ruxolitinib处理组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白的表达与空白对照组相比,均受到抑制(P<0.05)。药物浓度增加,蛋白表达量明显减少,差异存在统计学意义(P<0.05)。Western blot检测Ruxolitinib对MPN原代细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响:250 nmol/L Ruxolitinib作用48 h能明显抑制MPN原代细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达。结果显示,p-JAK2、MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显降低,在不同浓度的Ruxolitnib作用后。结论:1在JAK2V617F突变阳性初治组MPN患者中p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显高于对照组,应用Ruxolitnib后MPN患者p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达水平明显降低。2应用Ruxolitnib可明显抑制HEL细胞增殖,并随着Ruxolitnib浓度的增加时间的延长HEL细胞活力明显下降。3体外应用Ruxolitnib对MPN细胞CD34+表达水平明显抑制作用。4应用Ruxolitnib能下调HEL细胞JAK2、MMP-2、MMP-9 m RNA及其p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平,并随Ruxolitnib的浓度增加而进行性减低。5 Ruxolitnib对MPN原代细胞及HEL细胞迁移有明显抑制作用。