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背景
1976年7月，在费城的退役军人大会期间，暴发了一种原因不明的肺炎，约3000名与会者中，有221人犯病，34人死亡。后来的研究发现，该病由一种革兰阴性杆菌引起，因该病于军团人员中首次发现，故命名为军团病，引起本病的病原菌称为军团菌。目前已知的军团菌属至少有61个种，其中约30种可引起人类疾病。嗜肺军团菌为其模式菌种，是军团病临床上最相关的种。军团菌广泛存在于自然界的水和土壤中，在人工供水系统中含量高，并可以通过气溶胶传播。吸烟、酗酒和免疫力低下者易感染，多发于夏秋季。军团病临床特点为急性下呼吸道感染，可分为肺炎型和庞蒂亚克热，肺炎型为重型，死亡率约15-30%，免疫力低下者死亡率更高。前期，为研究我国军团菌的分布特点，本课题组在朱庆义教授等人的带领下从2003年到2014年，对中国大陆冷却塔、江河、湖泊等采集的环境水样和患者痰标本等，分离到军团菌772株，包含多个未知的新菌种。其中三株，命名为km488T、km489和km521，经16SrRNA基因测序分析显示，三株菌的16SrRNA序列完全一致，与属内最相近种的相似度小于98.5%，符合新种的定义，基于此我们选取这三株菌进行研究。
目的
本研究采用多相分类的方法，对取于自然水的军团菌样细菌（km488T、km489和km521）进行表型和分子生物学鉴定，确定其分类学地位，并对其进行命名和保存。
方法
1.经典分类
采用常规试验方法进行马尿酸还原酶、氧化酶和过氧化氢酶等生化试验，用APIZYM试剂盒进行酶学检测。选择属内相近种的标准菌株L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T作为参比菌株与实验菌株做平行试验，进行分析比较。
2.化学分类
采用高效液相色谱测定脂肪酸，选择属内相近的标准菌株L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T作为参比菌株与实验菌株做平行试验，进行比较分析。
3.分子分类
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）分析、16SrRNA基因、mip基因及管家基因测序，DNA-DNA杂交和基因组测序等技术对三株分离物进行分子分类。
结果
1.经典分类
km488T、km489和km521三株菌株与军团菌属细菌的基本特征一致，其均为革兰氏阴性杆菌，马尿酸还原酶阴性、脲酶阴性、糖酵解阴性、过氧化氢酶阳性、β-内酰胺酶阳性、明胶液化阳性且生长需要L-半胱氨酸。蓝白荧光和棕色色素试验阳性。
2.化学分类
km488T、km489和km521三个供试菌株的主要组分相同，主要脂肪酸成分为anteiso-C15:0、iso-C16:0和anteiso-C17:0，主要脂肪酸种类与参考菌株相同，主要脂肪酸含量与参考菌株有所区别。
3.分子分类
16SrRNA基因比对结果显示：km488T、km489和km521的相似度为100%，与L.gormaniiATCC33297T、L.parisiensis35299T和L.dumoffii33279T的相似度最高，为98.1%-98.2%。mip基因比对结果显示：km488T、km489和km521之间的相似度为99.5%，与L.gormaniiATCC33297T的相似度最高，为95.4%-95.6%；三株分离物的rpoB基因和rnpB基因序列完全一致，均与L.gormaniiATCC33297T相似最高，相似度依次为91.7%和99.0%。
单个基因与串联基因的系统发育树结果显示km488T、km489和km521为同一个进化群，与L.gormaniiATCC33297T亲缘关系密切。MALDI-TOFMS聚类分析显示，km488T、km489和km521单独形成一个聚类群，符合新种的定义。
DNA-DNA同源性的分析结果显示：km488T、km489和km521三株菌之间的杂交率＞70%，即该三株菌为同一个种。此外，该三株菌与已知亲缘性关系相近的L.gormaiiATCC33342T、L.dumoffiiATCC33279T、L.cherriiATCC35252T、L.anisaATCC35292T和L.parisiensisATCC35299T的杂交率＜70%，支持其新种的分类地位。
基因组序列分析显示：km488T、km489和km521三株菌之间的平均核苷酸一致性＞95%，即该三株菌为同一个种。该三株菌与已知亲缘性关系相近的L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T的平均核苷酸一致性＜95%，支持其新种的分类地位。该新种的G+Cmol%含量为37.8%。
结论
根据经典分类、化学分类和分子分类的试验结果，支持km488T、km489和km521三株菌为同一个菌种，km488T被指定为模式菌株（Typestrain），km488T=KCTC15636T=CCTCCAB2018025T=NRBC113223T。根据《国际细菌命名法》法则，命名为Legionellaqingyii（庆义军团菌），以宣扬朱庆义教授在军团菌领域的研究贡献。
1976年7月，在费城的退役军人大会期间，暴发了一种原因不明的肺炎，约3000名与会者中，有221人犯病，34人死亡。后来的研究发现，该病由一种革兰阴性杆菌引起，因该病于军团人员中首次发现，故命名为军团病，引起本病的病原菌称为军团菌。目前已知的军团菌属至少有61个种，其中约30种可引起人类疾病。嗜肺军团菌为其模式菌种，是军团病临床上最相关的种。军团菌广泛存在于自然界的水和土壤中，在人工供水系统中含量高，并可以通过气溶胶传播。吸烟、酗酒和免疫力低下者易感染，多发于夏秋季。军团病临床特点为急性下呼吸道感染，可分为肺炎型和庞蒂亚克热，肺炎型为重型，死亡率约15-30%，免疫力低下者死亡率更高。前期，为研究我国军团菌的分布特点，本课题组在朱庆义教授等人的带领下从2003年到2014年，对中国大陆冷却塔、江河、湖泊等采集的环境水样和患者痰标本等，分离到军团菌772株，包含多个未知的新菌种。其中三株，命名为km488T、km489和km521，经16SrRNA基因测序分析显示，三株菌的16SrRNA序列完全一致，与属内最相近种的相似度小于98.5%，符合新种的定义，基于此我们选取这三株菌进行研究。
目的
本研究采用多相分类的方法，对取于自然水的军团菌样细菌（km488T、km489和km521）进行表型和分子生物学鉴定，确定其分类学地位，并对其进行命名和保存。
方法
1.经典分类
采用常规试验方法进行马尿酸还原酶、氧化酶和过氧化氢酶等生化试验，用APIZYM试剂盒进行酶学检测。选择属内相近种的标准菌株L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T作为参比菌株与实验菌株做平行试验，进行分析比较。
2.化学分类
采用高效液相色谱测定脂肪酸，选择属内相近的标准菌株L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T作为参比菌株与实验菌株做平行试验，进行比较分析。
3.分子分类
采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）分析、16SrRNA基因、mip基因及管家基因测序，DNA-DNA杂交和基因组测序等技术对三株分离物进行分子分类。
结果
1.经典分类
km488T、km489和km521三株菌株与军团菌属细菌的基本特征一致，其均为革兰氏阴性杆菌，马尿酸还原酶阴性、脲酶阴性、糖酵解阴性、过氧化氢酶阳性、β-内酰胺酶阳性、明胶液化阳性且生长需要L-半胱氨酸。蓝白荧光和棕色色素试验阳性。
2.化学分类
km488T、km489和km521三个供试菌株的主要组分相同，主要脂肪酸成分为anteiso-C15:0、iso-C16:0和anteiso-C17:0，主要脂肪酸种类与参考菌株相同，主要脂肪酸含量与参考菌株有所区别。
3.分子分类
16SrRNA基因比对结果显示：km488T、km489和km521的相似度为100%，与L.gormaniiATCC33297T、L.parisiensis35299T和L.dumoffii33279T的相似度最高，为98.1%-98.2%。mip基因比对结果显示：km488T、km489和km521之间的相似度为99.5%，与L.gormaniiATCC33297T的相似度最高，为95.4%-95.6%；三株分离物的rpoB基因和rnpB基因序列完全一致，均与L.gormaniiATCC33297T相似最高，相似度依次为91.7%和99.0%。
单个基因与串联基因的系统发育树结果显示km488T、km489和km521为同一个进化群，与L.gormaniiATCC33297T亲缘关系密切。MALDI-TOFMS聚类分析显示，km488T、km489和km521单独形成一个聚类群，符合新种的定义。
DNA-DNA同源性的分析结果显示：km488T、km489和km521三株菌之间的杂交率＞70%，即该三株菌为同一个种。此外，该三株菌与已知亲缘性关系相近的L.gormaiiATCC33342T、L.dumoffiiATCC33279T、L.cherriiATCC35252T、L.anisaATCC35292T和L.parisiensisATCC35299T的杂交率＜70%，支持其新种的分类地位。
基因组序列分析显示：km488T、km489和km521三株菌之间的平均核苷酸一致性＞95%，即该三株菌为同一个种。该三株菌与已知亲缘性关系相近的L.gormaniiATCC33297T、L.bozemanaeATCC33217T、L.anisaATCC35292T、L.tucsonensisATCC49180T、L.parisiensisATCC35299T和L.dumoffiiATCC33279T的平均核苷酸一致性＜95%，支持其新种的分类地位。该新种的G+Cmol%含量为37.8%。
结论
根据经典分类、化学分类和分子分类的试验结果，支持km488T、km489和km521三株菌为同一个菌种，km488T被指定为模式菌株（Typestrain），km488T=KCTC15636T=CCTCCAB2018025T=NRBC113223T。根据《国际细菌命名法》法则，命名为Legionellaqingyii（庆义军团菌），以宣扬朱庆义教授在军团菌领域的研究贡献。