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鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的名贵淡水经济鱼类。近年来,鳜常受到细菌、病毒等病害的影响,对鳜的养殖业发展产生了极大的影响,造成严重的经济损失。本文采用 RACE-PCR的方法克隆了鳜两个重要的抗氧化酶—CAT和 GPX的 cDNA序列全长,分析了 CAT和 GPX mRNA在鳜组织内的表达;另外,对 CAT基因进行了原核表达。 1.鳜 CAT cDNA全长为2216bp,包括编码区1581bp,3’端非翻译区635bp,含有典型的腺苷酸信号序列 AATAAA和 PolyA尾。该基因序列开放阅读框(ORF)编码527个氨基酸,预测蛋白质分子量为59.8 kDa,等电点为7.26。BLAST分析显示鳜 CAT氨基酸序列和其它物种 CAT基因有很高的同源性。氨基酸序列分析发现鳜 CAT存在高度保守的过氧化氢酶近端血红素配体签名序列(354RLFSYPDTH362)和过氧化氢酶近端活性位点(64FDRERIPERVVHAKGAG80)以及3个催化位点残基“ H”、“ N”和“ Y”。另外,还有三个糖基化位点(148 NNTP151)、(439NFTQ442)和(507 NTTV510),12个NADPH结合位点和过氧化物酶体靶信号 SKM。系统发育树结果表明鳜与条石鲷的亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR检测鳜 CAT的 mRNA在组织中表达情况,结果显示鳜 CAT的 mRNA在9种组织中均有表达,其中在肝脏表达量较高。最后,构建了 ScCAT+pET-30a重组质粒并热激转入大肠杆菌 BL21(DE3)中,成功地诱导出了 ScCAT的天然可溶性重组蛋白,可用于后续重组蛋白的纯化、分析及抗体生产。 2.谷胱甘肽过氧化物酶是生物体机体抗氧化防御系统主要的酶类之一。鳜GPX基因 cDNA序列全长为948 bp,开放阅读框564 bp,3′非编码区384 bp,密码子 TGA编码1个硒半胱氨酸( Sec),不是终止密码子;3′非编码区形成1个硒半胱氨酸插入序列(SECIS元件)。鳜 GPX氨基酸序列的硒半胱氨酸插入序列元件属于 form1,与其它鱼类相比具有较高的同源性。氨基酸结构分析显示,鳜 GPX有 Sec催化位点 Gln71和 Trp148、稳定酶三级结构的3个环、PGGG结构域和由 Sec、Trp、Gln与 Asn构成的催化四联体。鳜 GPX与脊椎动物 GPX1和 GPX2氨基酸序列同源性为66％-91%。系统进化分析显示,GPX聚为3大支, GPX1、GPX2和 GPX3聚为一支,GPX4独为一支。实时荧光定量 PCR检测鳜GPX的 mRNA在各组织表达情况,结果显示鳜 GPX的 mRNA在9种组织中均有表达,不同组织表达量有明显差异,其中在肝脏、头肾和鳃中表达量较高。