组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA通过内质网应激干预糖尿病肾病的研究

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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)微血管并发症之一,是产生终末期肾衰竭(end stage renal disease,ESRD)的主要原因,严重威胁人们健康。人们认为DN主要原因是肾小球基底膜细胞损伤等,但是,最近研究发现DN时肾小管上皮细胞也存在明显的病理变化。可见,DN发病机制极其复杂,需要对DN的机制及治疗方法进行研究。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核生物中与分泌途径有关的重要的细胞器,它与蛋白的折叠、转运及翻译后修饰密切相关。内质网腔对外界刺激非常敏感,在缺血、缺氧、营养物质耗竭、钙稳态失衡、氧化应激等因素刺激下ER稳态失衡,导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的产生。ERS时内质网腔内错误折叠蛋白及未折叠蛋白堆积,ER通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)激活下游信号通路进行自我调节以减轻或终止ERS,对细胞起到保护作用。然而,当刺激持久或强烈时,ERS不可逆转,则启动ERS介导的细胞凋亡途径(ER-associated death,ERAD)导致细胞凋亡。因此,以ERS为治疗靶点的研究越来越受到人们的关注。糖尿病状态下,高血糖、游离脂肪酸增多、氧化应激等均是ERS的诱发因素,而DN是糖尿病晚期的慢性并发症,这些不良因素长期持久的刺激使ERS不可逆转,最终启动ERAD并与其他细胞损伤机制串话,起到级联放大效应,引起细胞凋亡,最终导致器官的衰竭。因此,抑制ERS可能会改善DN的发生与发展。目前研究表明DN时ERS相关蛋白的表达变化比较明确,但是这些蛋白的表达调控尚不清楚。真核生物基因表达是完整复杂的网络调控过程。真核生物基因表达调控包括基因组DNA水平的调控,其中染色质结构的改变对基因组DNA水平的调控影响较大。组蛋白乙酰化修饰与染色质结构改变关系密切,可以调控基因的转录。组蛋白乙酰化参与细胞的增殖,迁移和凋亡。组蛋白乙酰化与去乙酰化作用由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)与组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyl transferase,HAT)之间的动态平衡决定。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors,HDACIs)抑制HDAC,促进组蛋白乙酰化,影响基因转录活性,因此在神经退行性变,糖尿病,心血管疾病及自身免疫性疾病等方面均有广泛的研究。丙戊酸(Valproic acid,VPA)是HDACIs代表药物,可以非选择性的抑制HDAC,已有实验结果显示HDACIs对肾损伤有一定的保护作用,并有研究表明HDAC与ERS相关基因的转录有关。因此,我们推测HDACIs可能通过调控ERS相关蛋白的乙酰化水平减轻糖尿病肾损伤。本研究通过体内实验研究VPA对DN大鼠模型ERS、细胞凋亡及糖尿病肾损伤的影响,探讨了VPA是否通过ERS及细胞凋亡干预DN;通过体外实验研究了VPA对高糖诱导大鼠NRK-52E细胞的ERS及细胞凋亡的影响;并在NRK-52E细胞和DN大鼠模型中初步探讨VPA对DN的作用是否通过调控ERS相关基因的乙酰化水平从而影响基因的转录实现的。方法:在体内实验中通过给予Wistar大鼠注射STZ后继续高脂饲养22周,诱导形成DN模型,而后给予VPA灌胃8周后取材。对DN大鼠模型进行了生化代谢指标检测、组织病理学形态及透射电镜检查明确VPA对DN大鼠模型肾损害的影响。采用免疫组化、免疫荧光及Western blot的方法检测了ERS相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表达明确VPA对DN大鼠模型ERS的影响。采用TUNEL法检测细胞凋亡率及Western blot的方法检测相关凋亡蛋白P-JNK,ATF4,Bcl-2,Bax,cleaved-Caspase3的蛋白表达明确VPA对DN大鼠模型细胞凋亡的影响。在体外实验中,选择大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞系进行细胞培养。用MTT法确定VPA的使用浓度。用Western blot方法检测了ERS相关蛋白GRP78、CHOP及Caspase12的蛋白表达。采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测NRK-52E细胞的细胞凋亡率及用Western blot方法检测相关细胞凋亡蛋白P-JNK、ATF4、 Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3的表达水平。用比色法检测VPA在高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型中组蛋白H4总乙酰化水平,用CHIP法检测VPA在高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型中ERS相关蛋白GRP78及CHOP基因启动子组蛋白H4的乙酰化水平。结果体内实验结果表明VPA可以使DN大鼠模型血肌酐降低,24小时尿蛋白明显减少,但对大鼠模型的血糖、体重、肾重/体重的比值无影响。光镜下观察显示,DN大鼠模型肾小球体积变大,肾小球囊腔间隙缩小,肾小球基底膜不规则增厚,系膜基质增多,部分肾小管上皮细胞出现萎缩,VPA给药后以使上述形态改变不同程度减轻。透射电镜下观察肾脏超微结构显示,DN大鼠模型的肾小球基底膜明显不规则增厚,滤过膜三层结构不清晰,足突齿梳状紊乱,间隙增宽,内皮细胞呈“拱状”增生,系膜基质增多,可见大的吞噬泡。VPA给药后上述超微结构改变不同程度减轻。VPA可以增加DN大鼠模型GRP78、减少CHOP及Caspase12蛋白的表达,且主要发生在肾小管上皮细胞处;VPA可以减轻DN大鼠模型的细胞凋亡率,细胞凋亡也主要发生在肾小管上皮细胞处。VPA可以减少凋亡相关蛋白P-JNK, ATF4、Bax, cleaved-caspase3的蛋白表达,增加Bcl-2的蛋白表达,Bcl-2/Bax的比值升高。体外实验结果表明VPA可以增加高糖诱导NRK-52E细胞ERS相关蛋白GRP78的表达,降低CHOP及Caspase12的蛋白表达;减少NRK-52E细胞的细胞凋亡率,减少凋亡相关蛋白P-JNK、ATF4、Bax、cleaved-Caspase3的蛋白表达,增加Bcl-2的蛋白表达。VPA可以使高糖诱导NRK-52E细胞及DN大鼠模型组蛋白H4总乙酰化水平明显增高,并可以使NRK-52E细胞及DN大鼠模型中GRP78基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平增高,CHOP基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平减低。结论:1、大鼠注射STZ7天,血糖增加。22周后大鼠的24h蛋白尿、血肌酐明显增加。肾小球体积增大、基底膜不规则增厚、肾小管细胞发生明显的细胞凋亡等肾脏组织病理改变,提示发生了糖尿病肾损伤。2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA改变了ERS相关蛋白的表达,减轻了ERS,抑制细胞凋亡,表明了VPA可以减轻DN大鼠模型的肾损伤。3、体外实验进一步证实VPA可以减轻高糖诱导NRK-52E细胞的ERS,并减少其细胞凋亡。4、体内外实验表明VPA对ERS的调控可能是通过调控ERS相关蛋白GRP78及CHOP基因启动子区组蛋白乙酰化水平实现的。因此,以组蛋白去乙酰化酶为靶点的去乙酰化酶抑制剂可能为DN的治疗提供一个新的选择。
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