迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,简称E.tarda)感染宿主范围很广,是水产养殖业的重要病原体。它能够在巨噬细胞内生存和繁殖,是其致病的关键。已有研究表明Ⅲ型分泌系统(T3SS)是E.tarda的一个重要毒力因子,EseB、EseC和EseD是T3SS重要的转位子蛋白,其中EseC和EseD可插入宿主细胞膜,EseB则为游离部分。当E.tarda与宿主细胞接触后,EseB、EseC和EseD会迅速组成转运复合物在宿主细胞膜钻孔,可以将E.tarda的效应蛋白输入宿主细胞,影响E.tarda的胞内生存。EseC已被初步证明可影响E.tarda的胞内生存,但其具体机制不完全清楚。本文利用自杀质粒pHM5构建重组自杀质粒,运用同源重组原理,缺失Et.CD株的eseC基因,得到eseC缺失株,并用PCR鉴定。再用pACYC184质粒构建eseC基因的重组质粒,电击导入缺失株中,得到缺失菌株的互补菌株并鉴定。为了探索EseC是否影响E.tarda细胞毒性和感染的细胞凋亡,以不同的MOI野生株,eseC缺失株和互补株分别感染巨噬细胞后,采用CCK-8试剂盒检测巨噬细胞的存活率。结果提示,eseC基因缺失后,Et.CD株对细胞的毒性明显降低。以MOI 10:1大肠杆菌BL21,野生株、eseC缺失株和互补株分别感染巨噬细胞,延长培养2h和6h,流式细胞仪检测细胞凋亡和焦亡情况。结果提示,eseC基因的缺失,影响了 T3SS的表达,继而影响了 T3SS早期抑制巨噬细胞凋亡和诱导巨噬细胞焦亡。为了证明EseC影响Et.CD株在巨噬细胞胞内的生存。采用平板计数法,比较野生株、eseC缺失株和互补株以100:1的MOI分别感染巨噬细胞后,不同延长培养时间的胞内细菌存活数目。结果表明,虽然野生株、eseC缺失株和互补株均可在巨噬细胞内存活并繁殖,但缺失株胞内繁殖速率明显低于野生株和互补株,野生株和互补株繁殖速率没有差异,说明eseC基因对于维持Et.CD株在巨噬细胞内的繁殖速率起重要的作用。为了进一步探索EseC影响Et.CD株巨噬细胞胞内生存的机制,采用流式检测分别,比较野生株、eseC缺失株和互补株以10:1的MOI细菌感染巨噬细胞后,延长培养时间2h和6h,巨噬细胞产生活性氧和活性氮的水平。延长培养2h的结果显示,缺失株组明显高于野生株组,互补株组接近野生株组;这表明eseC基因对于E.tarda在巨噬细胞胞内早期生存很重要,抑制巨噬细胞产生活性氧和活性氮。体外应激实验结果也表明,相比野生株,缺失株对过氧化氢的敏感性显著提高。采用流式细胞仪收集标记过酸性探针的细胞,建立巨噬细胞内pH和标记酸性探针的细胞比率的标准曲线。野生株和缺失株分别感染巨噬细胞后,延长培养不同时间,流式细胞仪检测酸性探针的细胞,从标准曲线得出胞内pH。结果表明,野生株T3SS能够干扰巨噬细胞酸性环境的形成,而缺失株不干扰。采用RT-PCR检测E.tarda的T3SS效应蛋白基因eseE和eseJ的表达水平,并以16SrRNA基因作为内标参照。结果表明,eseC缺失株的中EseJ和EesE的转录水平比野生株明显降低,互补株中这些基因的转录水平与野生株之间并未有明显差别。这表明eseC基因的缺失影响了 EesE和EseJ分泌到宿主细胞内发挥效应。为了探索EseC蛋白是否可以影响E.tarda小鼠体内的生存,比较Et.CD野生株和eseC缺失株感染小鼠的半数致死量(LD50)。结果表明,野生株的毒力约为eseC缺失株的毒力4.05倍,说明eseC缺失株的毒力明显降低。与Et.CD野生株在小鼠体内存活能力对比,缺失株在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的细菌数目明显降低。比较野生株和eseC缺失株感染小鼠不同天数后,肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的外观和重量。发现除肾脏外,野生株感染组织的外观和重量均显著大于eseC缺失株。感染细菌的小鼠组织在不同时间点用苏木精—伊红染色后,用光学显微镜观察发现,eseC缺失株感染组的组织损伤和急性炎性反应均明显低于野生株感染组。用ELISA法检测感染E.tarda的小鼠血清中IL-1β和TNF-α的浓度,感染1～11d后,野生株组的IL-1β和TNF-α的浓度均明显高于缺失株组,结果表明,eseC的缺失,影响了E.tard 诱发细胞因子的产生。综上所述,E.tarda感染巨噬细胞后,EseC通过调节EseE和EseJ的产生,抑制巨噬细胞凋亡和细胞毒性,诱导巨噬细胞焦亡,抑制巨噬细胞产生活性氧和活性氮,干扰巨噬细胞的酸性环境,有利于细菌的毒力、细菌在巨噬细胞和小鼠体内的生存、引起小鼠急性组织损伤和急性炎症反应。本研究为深入探讨E.tarda菌T3SS的致病机制提供了重要的线索。