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海洋桡足类属于节肢动物门,桡足纲,是海洋生态系统中重要的次级生产者,对维持海洋生态系统衡和稳定起着重要作用。同时,桡足类的个体小,生命周期短,易受环境条件变化的影响的特性,使其成为在环境毒理学领域良好的模式生物。海洋桡足类的培养关键在于适宜条件的提供,不同种的海洋桡足类,甚至同一种类在不同发育阶段,都需要特定的环境条件及饵料需求。基于桡足类对海洋环境污染物具有的敏感性特点,对海洋环境变化下桡足类生物学特性影响的研究将有助于了解目前环境污染造成的海洋环境变化对桡足类的危害,从而为制定海洋生态环境保护标准提供了一定的借鉴意义。本文以海洋环境中三种重要的环境因子盐度、温度及pH的变化作为应激条件,以我国东海海域常见的浮游桡足类太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)为实验研究对象,进行急性实验,研究不同盐度、温度及pH条件下的太平洋真宽水蚤体内CRH-BP(Corticotropin Releasing Hormone-Binding Protein,促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白)及EcR(Ecdysone Receptor,蜕皮激素受体)基因的表达量变化,探讨了三种环境因子胁迫对太平洋真宽水蚤的毒性效应,为今后开展海洋环境生态监测以及生态风险性评价提供一定的科学依据。本文分为3个部分:第一部分:研究概述。主要对桡足类物种及其研究现状进行介绍,并对海洋环境污染及生物检测研究进展进行介绍;分析了桡足类在海洋环境监测与评价中的作用,论述了作为指标生物的应用前景与研究价值;还探讨了桡足类在分子毒理学中的研究意义,重点介绍了CRH-BP及EcR两种基因。第二部分:太平洋真宽水蚤CRH-BP基因克隆及表达分析。对盐度、温度及海水酸化环境胁迫下太平洋真宽水蚤体内CRH-BP基因的表达量随时间的变化特点进行了研究。本实验以太平洋真宽水蚤为材料提取总RNA,根据Genbank中桡足类CRH-BP基因序列保守区设计引物,扩增出CRH-BP基因的部分序列。经克隆测序验证为太平洋真宽水蚤CRH-BP基因的中间片段后,根据中间片段设计3’端和5’端特异性引物,分别进行3’RACE克隆和5’RACE克隆,经序列拼接获得CRH-BP基因全长cDNA序列。结果显示CRH-BP全长为1950bp,开放阅读框(ORF)由1245个核苷酸组成,共编码414个氨基酸(AA)。根据在线软件预测太平洋真宽水蚤CRH-BP分子量为45.816KDa,理论等电点为5.89,软件预测该蛋白为亲水性蛋白,具有明显的跨膜结构与酶切位点。DNAstar软件分析太平洋真宽水蚤CRH-BP与近亲真宽和虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)同源性最高。系统发育树结果表明太平洋真宽水蚤与近亲真宽水蚤(Eurytemor affinis)和虎斑猛水蚤聚为一支,亲缘关系最近,与昆虫类亲缘关系较远。根据克隆得到的CRH-BP基因设计qRT-PCR引物,采用qRT-PCR法对盐度、温度及海水酸化三种环境因子胁迫下太平洋真宽水蚤CRH-BP基因m RNA相对表达量进行分析。结果显示基因表达呈现出一定的浓度与时间效应,盐度及温度刺激一段时间后基因表达量显著增长,对于海水酸化响应更为敏感。CRH-BP基因表达量的增加可以缓解动物应激反应。第三部分:太平洋真宽水蚤EcR基因克隆及表达分析。对盐度、温度及海水酸化环境胁迫下太平洋真宽水蚤体内EcR基因的表达量随时间的变化特点进行了研究。本实验以太平洋真宽水蚤为材料提取总RNA,根据Genbank中桡足类EcR基因序列保守区设计引物,扩增出EcR基因的部分序列。经克隆测序验证为太平洋真宽水蚤EcR基因的中间片段后,根据中间片段设计3’端和5’端特异性引物,分别进行3’RACE克隆和5’RACE克隆,经序列拼接获得EcR基因全长cDNA序列。结果显示EcR全长为2782 bp,开放阅读框(ORF)由1563个核苷酸组成,共编码521个氨基酸(AA)。根据在线软件预测太平洋真宽水蚤CRH-BP分子量为53.798KDa,理论等电点为8.09,软件预测该蛋白为亲水性蛋白,无明显的跨膜结构与酶切位点。DNAstar软件分析太平洋真宽水蚤EcR与近亲真宽水蚤同源性最高,但N端氨基酸序列不同,说明EcR基因具有较强特异性。系统发育树结果表明太平洋真宽水蚤与近亲真宽水蚤和虎斑猛水蚤聚为一支,亲缘关系最近,与昆虫类亲缘关系较远。根据克隆得到的EcR基因设计qRT-PCR引物,采用qRT-PCR法对盐度、温度及海水酸化环境胁迫对太平洋真宽水蚤体内EcR基因的表达量随时间的变化特点进行了研究。结果显示基因表达呈现出一定的浓度与时间效应,短时间内对温度胁迫响应不明显,对于高盐及海水酸化响应更为敏感。通过分析急性环境胁迫下的太平洋真宽水蚤EcR基因的表达特征,可以进一步认定EcR参与了太平洋真宽水蚤的环境适应性调节过程,推断EcR是盐度、温度、海水酸化影响蜕皮的重要调控因子之一。