外源基因在受体细胞或个体中持续稳定表达对于基础研究和转基因应用具有重要意义。传统转基因技术一般通过随机插入的方式将外源基因整合到基因组中,这种方法虽然简单直接,却存在着固有的缺陷。其整合位点和拷贝数的不确定性,往往使外源基因在动物个体中表达不稳定或表达差异过人,严重限制了转基因动物的应用与发展。近年来,基于同源重组的定点整合技术的发展,使外源基因可以以单拷贝形式整合至预定的基因组位点上，有效克服了传统转基因技术随机整合的缺陷。可是这个位点我们如何选择,才能保证外源基因良性插入并高效表达,并没有得到解决。在此基础上,科研人员提出“安全位点”定点转基因技术,该技术是指外源基因以单拷贝的形式定点插入到动物受体基因组中的“安全位点”,此位点既可以保证外源基因持续稳定表达,同时对动物自身基因组没有影响,保证受体动物的安全。Rosa26位点是动物基因组中应用最为广泛的“安全位点”,最早由 Friedrich和Soriano在小鼠中发现。对Rosa26的研究发现,该位点可以支持外源基因在胚胎发育各时期及个体所有组织中广谱性表达,且对胚胎发育、动物个体没有不良影响。目前,利用Rosa26位点建立的定点修饰小鼠模型已有几百种,在基因功能研究、疾病模型研究、药物开发等领域发挥着重要作用。继小鼠Rosa26发现后,人、大鼠、猪、家兔、羊的Rosa26位点先后被确定,通过研究发现,该位点在各物种中具有高度的同源性、保守性,均支持外源基因持续稳定高表达。牛,作为一种重要的农业经济动物,对其进行遗传改造,培育更加安全、具有更高牛乳品质、具有抗逆抗病等优良性状的品系是当前研究的热点。鉴定和定点修饰牛的安全位点Rosa26,不仅可以有效解决常规转基因修饰带来的诸多问题,更可以为制备外源基因稳定高表达的转基因大动物品系提供有效途径。本研究通过多重序列比对的方式,利用小鼠、大鼠、猪和人的Rosa26跨物种保守序列搜索牛的基因组数据库,在牛22号染色体上定位到一段同源性高达75%的序列,该序列区段上下游基因与已报道物种Rosa26 上下游基因一致。我们初步认为牛22号染色体上定位的序列为牛的Rosa26（bovine Rosa26,bRosa26）。3’RACE、5’RACE实验检测到该位点由两个外显子组成,编码一个转录本。RT-PCR、Q-PCR实验证实bRosa26在牛的各组织中广泛表达。将bRosa26启动子序列克隆至至绿色荧光蛋白表达载体上,瞬时转染多个组织来源的细胞系,均检测到绿色荧光蛋白的表达,在细胞水平上证实bRosa26启动子具有启动外源基因表达的活性。结合TALENs技术,本研究高效的将Cre重组酶介导的报告基因重组系统定点整合在bRosa26位点上,并利用TAT-Cre蛋白在细胞中实现了高效的Cre-loxP介导的重组反应。利用体细胞核移植技术,本研究成功制备bRosa26基因打靶胎儿和牛。RT-PCR、Q-PCR、Western Blot等实验证实,外源基因EGFP在胚胎发育各时期、个体各组织中稳定广泛表达,且其表达对bRosa26上下游600 Kb表达框内所有基因的表达未造成显著干扰,在个体水平上证实bRosa26位点是一个支持外源丛因广谱性表达的安全位点。本研究利用bRosa26基因打靶胎儿成功建立了成纤维细胞系,一对异源loxP位点的引入,可以基于重组酶介导的盒式交换（Recombination-mediated cassette exchange,RMCE）实现基因替换。利用此成纤维细胞系,我们高效地将绿色荧光蛋白EGFP替换为红色荧光蛋白tdDIMER,证实bRosa26位点可以介导高效的RMCE实现基因替换。本研究将三种广谱型启动子启动EGFP表达的打靶载体高效地定点整合在bRosa26位点上，在细胞水平上检测到EGFP均能持续稳定表达,且其表达对bRosa26上下游邻近基因的表达未造成显著干扰。其中CAG启动子启动EGFP的表达活性高于EF1a、PGK以及bRosa26内源启动子,证实bRosa26位点支持外源启动子启动外源基因的友好表达。本研究首次在牛的基因组中寻找并鉴定了安全位点Rosa26,结合TALENs技术成功对该位点实现了高效地定点修饰。结合穿膜肽TAT-Cre蛋白成功在牛细胞中实现了高效地Cre-loxP介导的重组反应。结合体细胞核移植技术成功制备了稳定表达EGFP胎儿成纤维细胞系及动物个体。同时,在建立的基于RMCE的基因替换成纤维细胞系中,实现了红色荧光蛋白的替换,这为后期任意基因通过RMCE技术定点整合至bRosa26,实现任意基因在牛中持续稳定高表达奠定了良好的基础。本研究克服了传统转基因技术的诸多弊端,极大地提高了外源基因在牛基因组中的整合效率,为在牛基因组中实现安全、精确的基因修饰建立了良好的工具,对基因定点修饰牛在产业化、商业化中的应用具有重要的推动意义。