椎间盘退变性疾病(Degenerative disc disease,DDD)临床极其常见,是引起颈肩腰腿疼痛的主要原因之一。资料显示,我国DDD患病率逐年上升,已成为严重影响大众健康和生活质量的主要疾病之一。目前DDD的治疗方法主要包括药物对症和手术治疗等,但这些治疗均未能针对椎间盘退变的病理生理过程,远期疗效不令人满意。近年来,细胞移植和基因治疗等生物学方法逐渐成为DDD治疗的研究热点,并有望在退变早期有效阻止或逆转椎间盘退变过程。目前已经发现,椎间盘退变始发于髓核,最主要病理特征是髓核细胞总数量减少、细胞外基质合成代谢与分解代谢失平衡,具体表现为椎间盘内髓核细胞凋亡减少,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖等细胞外基质合成减少、降解增多,而炎症反应在此过程中起着关键性作用。针对此病理特征,学者们尝试通过细胞移植和生长因子注射等生物学方法修复退变的髓核。然而,研究结果表明,现有的生物学方法依然未能阻止或逆转椎间盘退变过程,修复效果远未达到预期目标,距离临床应用尚有很大的距离。椎间盘是人体最大无血管组织,局部为一特异性酸性环境。最新研究发现,退变椎间盘酸性环境也是导致髓核退变的关键因素之一。因椎间盘内为低氧状态,其主要由无氧糖酵解供能,代谢产物乳酸致使椎间盘内pH值(5.7至7.2)明显低于正常人体内环境的pH值(7.35至7.45),椎间盘内形成特有的酸性环境。椎间盘退变时,其pH将进一步降低,甚至达到pH5.5的状态。多项研究发现,退变椎间盘酸性环境不仅抑制髓核细胞外基质合成,并可促进细胞外基质降解。因此,有学者认为退变酸性环境是制约其生物学修复效果的主要“瓶颈”。明确退变椎间盘酸性环境下调髓核退变的关键调控因子,阐明其相关作用机制,以及有效抑制该因子已成为当前椎间盘退变生物学治疗亟需解决的问题之一。卵巢癌 G 蛋白偶联受体 1(Ovarian cancer G protein-coupled receptor 1,OGR1)亚家族是近年来发现的一类对H+敏感的G蛋白偶联受体,包括OGR1、G蛋白偶联受体4(G protein-coupled receptor 4,GPR4)、G2A和T细胞死亡偶联基因8等四个成员。在酸性环境下,OGR1等受体可感知细胞外H+并介导细胞内多条信号通路,参与细胞免疫和炎症反应等过程。在该亚家族成员中OGR1和GPR4在人体内的分布最为广泛,存在于气道上皮细胞、卵巢细胞、血管内皮细胞和肾脏细胞等。现已发现,在这四个成员中尤其以GPR4对H+的敏感性最强。在酸性环境下GPR4可通过促进细胞内环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)蓄积或钙离子动员,上调白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症介质的表达,进而启动局部炎症反应。研究发现,在多种类型细胞中,cAMP作为细胞内第二信使可激活下游的关键性炎症信号通路有丝分裂活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)通路。虽然,髓核退变的确切发病机制尚未完全阐明,但退变髓核组织中含有大量炎性介质,炎症反应已被认为是导致髓核退变的主要因素之一。在国家自然科学基金青年基金(81501908)的资助下,我们探索了 GPR4在髓核退变过程中的作用,并发现GPR4的特异性抑制剂EIDIP能抑制cAMP在细胞内的蓄积水平和炎症介质IL-1β、TNF-α的表达。基于退变椎间盘酸性环境(高H+浓度)和炎症反应是导致髓核退变的关键因素,GPR4等受体又是特异的细胞H+感受器并可介导炎症反应,我们提出以下科学问题:退变椎间盘酸性环境下,GPR4通过介导cAMP蓄积激活MAPK信号通路,启动炎症反应抑制细胞外基质合成并促进细胞外基质降解,进而调控髓核退变。目前,国内外尚无相关研究报道。为论证上述问题,我们将在本课题完成以下三部分研究内容,分别是:(1)体外退变椎间盘酸性环境下GPR4调控髓核退变的作用研究;(2)GPR4介导cAMP蓄积调控髓核退变的具体分子机制研究;(3)体内水平GPR4调控髓核退变的具体作用研究。第一部分 体外退变椎间盘酸性环境下GPR4调控髓核退变的作用研究目的:阐明体外水平退变椎间盘酸性环境下,GPR4调控髓核细胞细胞外基质合成、炎症介质和细胞外基质降解酶表达的具体作用。方法:采用酶消化法分离培养SD大鼠髓核细胞,配置pH值为7.2、6.8和6.4三种不同的髓核细胞培养液分别模拟正常、轻度退变和严重退变椎间盘的酸性环境。采用实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测不同酸性条件处理7天GPR4的表达水平。采用基因转染和RNA干扰等方法过表达和敲除GPR4,并将细胞在不同酸性条件处理7天。采用Real-time PCR检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ 型胶原、IL-1β、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、基质金属蛋白酶-3,13(Matrix metalloproteinase-3,13,MMP-3,13)和解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5)的 mRNA表达水平。采用细胞免疫荧光染色(Immunofluorescence)和免疫组化染色(Immunohistochemistry)评价聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的蛋白表达水平。采用阿利新蓝染色检测糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)的分泌水平。结果:Real-time PCR和Western blot的结果提示,在正常椎间盘酸性环境下(pH 7.2)GPR4的表达水平较低,但在退变椎间盘酸性环境下(pH 6.8和6.4)GPR4的表达水平明显升高。Real-time PCR结果提示,退变椎间盘酸性环境下,GPR4过表达将进一步抑制聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,促进炎症相关的IL-1β、TNF-α、iNOS、MMP-3,13和ADAMTS-5等的表达。相反,敲除GPR4将提高聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达水平,抑制IL-1β、TNF-α、iNOS、MMP-3,13和ADAMTS-5的表达。免疫荧光染色和免疫组化染色结果进一步证实,退变椎间盘酸性环境下,GPR4过表达将抑制聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成,而敲除GPR4将提高聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成水平。阿利新蓝染色结果发现,退变椎间盘酸性环境下GPR4过表达将引起GAG的分泌水平下降,而敲除GPR4可提高GAG的分泌水平。结论:本部分研究显示退变椎间盘酸性环境下,GPR4表达水平明显升高,而且GPR4具有抑制髓核细胞细胞外基质合成、促进炎症介质与细胞外基质降解酶合成的作用。第二部分 GPR4介导cAMP蓄积调控髓核退变的具体分子机制研究目的:阐明退变椎间盘酸性环境下GPR4介导cAMP蓄积进而调控髓核退变的具体分子机制。方法:配置pH值为7.2、6.8和6.4的培养液模拟正常和退变椎间盘的酸性环境,并处理髓核细胞,通过酶联免疫法(enzyme immunoassay,EIA)法测定细胞内cAMP的蓄积水平。配置pH值为6.4的培养液模拟严重退变椎间盘的酸性微环境,并处理髓核细胞24h,通过Western blot检测c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 MAPK的磷酸化水平。将敲除与过表达GPR4的髓核细胞在pH 6.4的条件下培养24h,再次检测JNK和p38 MAPK的磷酸化水平。采用cAMP的抑制剂SQ 22536和蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)的抑制剂H-89处理髓核细胞,通过Western blot检测p38 MAPK和JNK的磷酸化水平。采用JNK的特异性抑制剂SP600125和p3 8 MAPK的特异性抑制剂SB203580处理GPR4过表达细胞,使用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)观察IL-1β、TNF-α、iNOS、MMP-3,13 和 ADAMTS-5 的表达变化情况。结果:退变椎间盘的酸性环境下,髓核细胞内cAMP的蓄积水平随pH降低而升高,GPR4过表达将引起cAMP蓄积水平进一步升高。严重退变椎间盘的酸性环境下,JNK和p38 MAPK的磷酸化水平升高,GPR4过表达将进一步促进JNK和p38 MAPK的磷酸化水平,而GPR4敲除则抑制JNK和p38 MAPK的磷酸化水平。此外,抑制cAMP和PKA的活性同样可抑制JNK和p38 MAPK的磷酸化水平。ELISA检测发现,JNK和p38 MAPK的抑制剂可降低GPR4过表达细胞IL-1β、TNF-α、iNOS、MMP-3,13 和 ADAMTS-5 的表达。结论:退变酸性环境下GPR4介导髓核细胞cAMP蓄积,激活JNK和p38 MAPK信号通路,进而调控髓核退变。第三部分 体内水平GPR4调控髓核退变的具体作用研究目的:应用大鼠椎间盘退变模型在体内水平验证GPR4调控髓核退变的作用。方法:将72只雄性SD大鼠随机分成四个组:正常对照组(无操作)、退变对照组(针刺操作)、PBS注射组(针刺操作、PBS注射)和GPR4治疗组(针刺操作、GPR4 shRNA注射),每组设4周、8周和16周三个时间点,每个时间点6只大鼠。通过经皮穿刺的方法构建大鼠椎间盘退变动物模型。采用钼靶X线观察椎间盘高度的变化并计算椎间盘高度指数(discheightindex,DHI),采用T2加权磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)评估髓核含水量,通过组织学HE、番红0染色等方法评估GPR4敲除延缓髓核退变的效果。结果:GPR4 shRNA体内注射3天后GPR4的表达水平出现明显下降。不同时间点的钼靶X线和MRI检测结果提示,相比正常对照组,PBS注射组的椎间盘高度和髓核含水量下降最为明显,退变对照组次之,GPR4治疗组的下降程度则为最少。组织学HE、番红O染色结果同样发现GPR4治疗组的髓核退变程度最轻。结论:GPR4 shRNA体内注射可有效延缓髓核退变过程,GPR4是调控髓核退变关键分子之一。