粘蛋白是生物机体内最古老的防御体系的重要成分之一,在众多生命活动过程中发挥着极其重要的作用。然而几乎所有粘蛋白目前已知的功能均是在哺乳动物中发现的,对禽蛋中粘蛋白的研究相对较少。本文以鸡蛋蛋清中的粘蛋白(ovomucin)为研究对象,以ovomucin的结构与功能为核心,在纯化出高纯度和高活性蛋白质的基础上,研究了提高ovomucin溶解性的方法,并对其体外抗菌、抗病毒感染的活性与生化机制开展了系列研究工作。主要研究内容和结果如下：首先采用分步等电点盐析结合凝胶过滤色谱法从鸡蛋清中分离纯化ovomucin,其过程为：50mmol/L CaCl2溶液制备较高含量的ovomucin,后用50mmol/L MgCl2进一步除去溶菌酶,再经Sephacryl S-300HR凝胶过滤法纯化,进样体积为2mL,洗脱液为含0.05mol/L MgCl2的Tris-HCl (20mmol/L pH8.4),流速为0.5mL/min。质谱鉴定结果表明所得蛋白质为ovomucin,不含其它蛋白质肽段信息。HPLC和SDS-PAGE分析结果显示其纯度为99.13%。采用此方法制备的ovomucin终产率为(57.03±1.22)%,总回收率为(40.87±0.76)%。纯化后的ovomucin对新城疫病毒(NDV)LaSota株的半数抑制浓度(IC50)为5.78±0.09μg/mL.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明低浓度MgCl2可以显著提高ovomucin对NDV的粘附能力(P<0.05)。氨基酸分析显示获得的ovomucin富含Ala, Thr, Pro和Val,具有典型的粘蛋白特性,同时含有较多硫酸基、唾液酸、糖醛酸和己糖,具有作为抗菌抗病毒研究的潜在结构基础。研究了提高ovomucin溶解性的方法与机制。溶解性测定结果表明,水不溶性ovomucin在1mol/L精氨酸中溶解度为(21.14±1.47)%,是其在蒸馏水(1.96%)中的10倍以上。荧光猝灭实验表明精氨酸在低浓度时通过静电作用与ovomucin形成静态复合物,二者在不同温度下结合常数Ka分别为3.282L·mol-1(298K)、2.404L·mol-1(308K)和1.904L·mol-1(313K),结合位点数n分别为1.141(298K)、1.130(308K)和1.118(313K)。电导法和芘荧光探针实验结果发现,精氨酸浓度小30mmol/L时主要通过静电作用与ovomucin结合,未引起ovomucin结构的显著变化；精氨酸浓度在30-100mmol/L时,复合体中出现大量疏水微区。ANS和FT-IR分析结果表明,在精氨酸浓度大于100mmol/L以后,ovomuicn二级结构中的无规则卷曲增加,折叠结构及螺旋结构减少,分子间聚集程度减弱,ovomucin的表面疏水性显著降低。粘附试验结果表明,添加100mmol/L精氨酸并未导致ovomucin对NDV粘附活性的显著降低(P>0.05),因此可以应用精氨酸实现ovomucin的非变性有效增溶。测定了ovomucin的抗菌活性及其对环境条件的稳定性。结果表明：ovomucin对大肠杆菌和沙门氏菌最小抑菌浓度分别为0.05mg/mL和0.4mg/mL,相应的抑菌率分别为(61.23±6.5)%和(34.34±4.4)%,而对金黄色葡萄球菌则无明显抑制作用。细菌生长曲线的测定结果发现,0.05mg/mL的ovomucin可以有效抑制大肠杆菌的增殖,但其仅能延缓沙门氏菌的对数生长期。粘附试验结果表明,ovomucin对三种细菌均具有一定的粘附能力,ovomucin浓度由2.5μg/mL增大到30μg/mL时,其对大肠杆菌的粘附率由19.3%升高到64.4%,对沙门氏菌的粘附率由22.1%升高到68.3%,对金黄色葡萄球菌的粘附率由16.3%升高到68.5%,但相同粘度的ovomucin对不同细菌粘附效率之间无显著性差异(P>0.05)。不同pH处理对ovomucin抗菌活性影响显著(P<0.05),在酸性条件下ovomucin对大肠杆菌的抑制率较低,随着pH升高抑菌率增大,在pH7-9条件下对大肠杆菌的抑制效果最好。Ovomucin的抗菌活性对温度具有较好的耐受性,即使经100℃处理10min,ovomucin对大肠杆菌的抑菌率仍可达60%以上。在建立ovomucin抗病毒模型的基础上,通过细胞病变程度、细胞存活率、病毒抑制率以及血凝抑制等指标,评价ovomucin对流感病毒H5N1、H1N1以及新城疫病毒LaSota、Ⅴ-4和Ⅳ系的抑制作用,结果发现ovomucin对五株不同毒株均具有一定的抑制效果,与病毒混合后能明显降低病毒感染力,0.25mg/mL的ovomucin对H5N1、H1N1以及新城疫病毒Ⅱ、Ⅴ-4和Ⅳ系的血凝抑制率分别为(72.89±6.02)%、(64.29±7.94)%、(71.15±6.41)%、(60.32±9.16)%和(74.26±7.35)%。细胞实验发现ovomucin对H5N1早期吸附进入细胞的抑制效果最好,0.25mg/mL的ovomucin对H5N1在MDCK细胞上的病毒抑制率为77.85%。不同来源粘蛋白对H5N1的抗病毒活性存在差异,ovomucin的对H5N1的抑制效果高于牛下颌腺粘蛋白,但是略低于猪胃粘蛋白。为进一步探讨ovomucin抗H5N1的生化机制,通过改变加药方式,从体外细胞水平的抗病毒作用环节结合直接显微观察探讨ovomucin体外抗流感病毒的作用环节,结果表明ovomucin抗病毒作用是通过抑制病毒感染细胞早期的吸附或进入过程实现的。血凝实验和神经氨酸酶抑制实验结果证明ovomucin主要通过抑制H5N1表面血凝素(HA)识别细胞的过程达到抑制病毒侵染的目的,同时ovomucin也起到一定的保护细胞作用。ELISA和双偏振极化干涉测量(DPI)结果表明ovomucin可以与HA抗原发生有效结合；DPI实验进一步分析ovomucin与H5N1表面HA的相互作用过程,发现二者以嵌入式的方式发生结合。因此ovomucin抗HsN1感染的机制为：ovomucin与HA通过嵌入式结合,抑制HA对MDCK细胞受体的识别,从而影响H5N1侵染早期对宿主细胞的吸附和侵入,进而抑制病毒增殖,在这个过程中还伴随着ovomucin和宿主细胞表面发生相互作用来保护细胞免受病毒侵染的过程。采用傅里叶变换红外光谱法和二维相关分析技术研究了ovomucin构象转变与温度之间的关系。结果显示,25-95℃升温过程中ovomucin分子二级结构的变化次序依次为：a-螺旋,p-折叠,p-转角,无规卷曲。Ovomucin构象在pH8.4-9.0之间有中间体存在。红外光谱拟合结果表明低浓度Mg2+与ovomucin糖基结合,未造成ovomucin二级结构的显著改变。而高浓度Mg2+会影响ovomucin的肽骨架及其空间构象,使ovomucin的无规则卷曲结构减少,β-转角和p-折叠结构增加。动态光散射结果表明添加0.1倍质量浓度的Mg2+可以使0.5mg/mL的ovomucin的平均粒度由60.23nm下降到51.39nm,说明Mg2+的加入会使ovomucin的分子结构变得更为紧密。pH诱导ovomucin构象与活性的分析结果表明,随着溶液中p-转角含量由20.7%增加到39%,ovomucin对H5N1血凝的抑制率也相应由53.9%提高到73.1%,Mg2+对ovomucin结构与功能的影响结果发现,加入Mg2+以后,ovomucin二级结构中的p-转角含量由19.11%增加到22.96%,相应的对病毒的粘附率可以由30%左右提高到68.9%。上述结果说明ovomucin结构有序性和紧密程度越高,其抗病毒活性越强。