随着经济的快速发展、社会老龄化和生活方式的改变,肥胖和2型糖尿病发病率呈快速增长趋势,已成为全球重要的公共健康问题之一,而胰岛素抵抗作为动脉粥样硬化、高脂血症、2型糖尿病、肥胖等许多代谢性疾病的共同土壤,已成为研究的热点。其中肝脏是机体物质代谢中心,也是胰岛素作用的重要器官,肝脏产生胰岛素抵抗时会影响糖脂代谢,机体出现血糖升高,肝内脂质沉积,进一步加重胰岛素抵抗,二者形成恶性循环。MicroRNA(又称miRNA)是一类参与基因转录后水平调控的非编码小分子单链RNA。新近研究表明miRNA与肥胖和糖尿病关系密切。Higuchi等人通过miRNA芯片方法筛选出高脂诱导的肥胖小鼠模型肝脏及内脏白色脂肪组织中miR-802的表达是上调的;与糖耐量正常的人群相比,糖尿病患者血清中miR-802表达升高,提示miR-802可能与糖代谢、胰岛素抵抗有关,其具体关系和作用机制值得进一步研究。本课题首先通过HepG2细胞系构建棕榈酸诱导的胰岛素抵抗模型,观察miR-802与肝脏胰岛素抵抗及糖代谢的关系,随后通过在该细胞模型上转染模拟物和抑制剂分别上调和下调miR-802的表达,进一步确定miR-802对肝脏胰岛素敏感性的调节作用;之后通过基因芯片对miR-802调节肝脏胰岛素敏感性的潜在靶基因进行筛选;最后通过尾静脉注射腺相关病毒实验,在高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠模型上进一步明确miR-802调节肝脏胰岛素敏感性及糖代谢的机制,为阐明胰岛素抵抗的发病机制、寻找新的药物靶点提供理论依据。第一部分MiR-802对棕榈酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗及糖代谢的影响目的:应用棕榈酸诱导HepG2细胞构建胰岛素抵抗细胞模型,通过上调或者下调miR-802的表达,观察葡萄糖代谢和胰岛素信号通路关键指标的变化,明确miR-802与肝脏糖代谢及胰岛素敏感性的关系。方法:在棕榈酸培养的HepG2细胞中通过转染miR-802的模拟物或者抑制物来上调或者下调肝细胞内miR-802的表达,分为以下六组:正常对照组(Con),棕榈酸干预组(PA),棕榈酸+miR-802模拟物组(miR-802-mimic),棕榈酸 + 模拟物对照组(mimic-negative control,mimic-NC),棕榈酸 + miR-802 抑制物组(miR-802-inhibitor),棕榈酸+抑制物对照组(inhibitor-negative control,inhibitor-NC)。应用化学法测定转染后各组细胞培养基中葡萄糖的浓度;提取miRNA及总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测miR-802的mRNA水平及胰岛素信号通路IRS-2、PI3K和AKT及糖代谢G6PC和GSK-3 β的mRNA表达。应用Western blot技术检测相关总蛋白的变化和磷酸化表达。结果:1体外构建HepG2细胞的IR模型经PA干预24小时后HepG2细胞培养基中葡萄糖含量PA组比正常对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示经PA干预后HepG2的胰岛素敏感性下降,在体外实验中成功构建了胰岛素抵抗模型。2转染HepG2细胞后各组miR-802的mRNA表达与Con组相比,PA干预组的miR-802表达升高(P<0.05),差异有统计学意义;MiR-802-mimic组,其miR-802的mRNA水平较对照mimic-NC 组升高(P<0.05);而 miR-802-inhibitor 组中 miR-802 的 mRNA水平较对照inhibitor-NC组降低(P<0.05)。3 MiR-802的上调/下调对胰岛素信号通路中相关蛋白表达的影响3.1胰岛素信号通路关键基因的转录水平测定与 Con 组相比,PA 组 HepG2 细胞 INSR、IRS-2、PI3K 和 AKT 的mRNA表达下降;上调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照组mimic-NC相比,PI3K的mRNA表达进一步下降(P<0.05);下调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照组inhibitor-NC相比,PI3K的mRNA表达升高(P<0.05)。无论上调或者下调HepG2细胞miR-802的表达,INSR、IRS-2和AKT的mRNA表达无明显改变(P>0.05)。3.2胰岛素信号通路关键基因的蛋白表达的变化在PA干预组中IRS-2、PI3K和AKT总蛋白的表达较Con组无明显变化,但IRS-2蛋白的丝氨酸磷酸化水平升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平减少,且差异有统计学意义(P<0.05)。上调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照mimic-NC组相比,miR-802组IRS-2、PI3K和AKT总蛋白的表达无显著性改变,但IRS-2蛋白的磷酸化水平进一步升高,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平均进一步下降;下调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照组 inhibitor-NC 组相比,miR-802-inhibitor 组 IRS-2、PI3K和AKT总蛋白的表达仍无显著性改变,但IRS-2蛋白的磷酸化水平降低,PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平升高。4 MiR-802的上调/下调对糖代谢的影响4.1 MiR-802的上调/下调对培养基中葡萄糖浓度的影响与Con组相比,PA干预24小时后其培养基中葡萄糖浓度升高(P<0.05);上调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照mimic-NC组相比,miR-802组培养基中葡萄糖浓度进一步升高(P<0.05);下调HepG2细胞 miR-802 的表达后,与对照 inhibitor-NC 组相比,miR-802-inhibitor组培养基中葡萄糖浓度降低(P<O.05)。4.2 MiR-802的上调/下调对各组细胞葡萄糖代谢关键酶表达的变化与Con组相比,PA组G6PCmRNA和蛋白表达均升高(P<0.05);上调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照mimic-NC组相比,G6PC的mRNA和蛋白表达进一步升高(P<0.05);下调HepG2细胞miR-802的表达后,与对照inhibitor-NC组相比,G6PC无论mRNA还是蛋白表达均降低(P<0.05)。第二部分MiR-802调节HepG2细胞胰岛素抵抗及糖代谢的潜在机制和靶基因筛选目的:在明确miR-802对肝脏胰岛素敏感性的调节作用的基础上,进一步通过基因表达谱芯片和生物信息学方法筛选miR-802影响肝脏胰岛素敏感性的潜在靶点,并通过Western-blot进行体外验证。方法:HepG2细胞转染同第一部分工作,取其中的棕榈酸干预组(PA),棕榈酸 + miR-802 模拟物组(miR-802-mimic,miR-802),棕榈酸+模拟物对照组(mimic negative control,NC)交由上海伯豪生物技术有限公司公司进行Human Genome U133 Plus 2.0 Array型号的芯片检测。通过对芯片数据进行差异表达分析、功能富集分析筛选miR-802过表达所影响的信号通路,进而推测miR-802调控肝脏糖代谢和胰岛素敏感性的潜在机制。通过Targetscan对miR-802的靶点进行预测,同时结合芯片数据筛选出miR-802影响胰岛素信号通路的靶基因,通过Westem-blot在HepG2细胞上进行验证。结果:1转染HepG2细胞后各组miR-802的mRNA的表达与PA干预组和对照NC组相比,过表达miR-802组,其miR-802的mRNA水平明显升高(P<0.05)。2芯片结果分析2.1主成份分析对PA组、miR-802组和NC三组样本进行主成分分析,结果如图3所示。在该图中,NC组和PA组的表达谱相近,说明空载体转染对整个体系无明显影响;而这两组与miR-802组在基因表达水平上有较大差异,说明miR-802的过表达从整体上影响了 HepG2细胞的基因表达。2.2差异基因筛选由于主成份分析结果显示NC组和PA组表达谱相近,因此我们以NC组为对照,根据正文第二部分中2.3.2节的方法从miR-802组筛选差异基因,结果如图3所示。与NC转染组比较,miR-802转染的HepG2细胞株中有505个基因发生了显著上调(倍数值>2.0);有104个基因受到显著下调(倍数值>2.0)。2.3 MiR-802过表达体系的功能富集分析我们将差异基因分别映射到GO和KEGG数据库,进行功能富集分析,结果如图4所示。观察图4发现,在排名前10位的信号通路中,miR-802的过表达显著影响了磷酸肌醇信号通路和肌醇磷酸盐代谢通路(TOP3)。芯片数据显示,miR-802的过表达使磷酸肌醇3激酶调控亚单位2(Phosphoinositide 3 kinase regulatory subunit,PIK3R2)的表达量减少约 2倍,人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)表达升高。PIK3R2 是 PI3K 的调节亚基 2,又被称为PI3KP85调节亚基β。而我们Western blot所用的PI3K的抗体检测的是P85亚基的水平,因此在蛋白水平上检测PI3KP85的表达可以代表PIK3R2的蛋白表达。PIK3R2可以促进磷酸肌醇三磷酸(Phosphoinositide 3 phosphoric acid,PIP3)的生成,而PTEN可以促进PIP3去磷酸化从而生成PIP2。因此,下调的PIK3R2和上调的PTEN可能共同抑制PIP3的生成,进而降低下游AKT的磷酸化水平,影响肝细胞的糖代谢和胰岛素敏感性。此外,该通路的上游调控基因细胞因子信号抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3,SOCS3)在 miR-802 过表达组上调了 1.9倍。SOCS3可以竞争性抑制IRS酪氨酸磷酸化,减少IRS与PI3K的调节亚单位P85的结合。因此,上调的SOCS3可能进一步抑制PI3K-AKT信号通路。同时,该通路的下游基因葡萄糖6磷酸达组增加约1.7倍,提示miR-802可能通过PI3K-AKT通路促进糖异酶催化亚基(Glucose 6 phosphatase catalytic subunit,G6PC)在 miR-802 过表生过程。该机制如图5所示。综上,miR-802的过表达可以使PI3K-AKT信号通路关键基因表达量减少,SOCS3表达量增多,从而影响肝脏糖代谢过程,进而影响葡萄糖稳态及胰岛素敏感性。3靶基因的预测及验证在确定了 miR-802影响糖代谢和胰岛素敏感性等相关通路的基础上,我们对其潜在的分子机制作了进一步探索。通过Targetscan预测miR-802的靶基因,并结合表达谱芯片对预测到的靶点进行筛选,取预测为阳性且在miR-802过表达组显著下调的基因作为miR-802的靶点,共筛选到17个候选靶基因,结果如图7表所示。其中,肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF1B)是青年人中的成年发病型糖尿病(maturity-onset diabetes mellitus of the young,MODY)的重要致病基因,大量研究表明其与疾病的关系。根据Targetscan的预测结果,miR-802与HNF1B的mRNA的3’ UTR端有大于6个理论结合位点(Fig.8)。MiR-802可以通过这些位点与HNF1B的mRNA结合,以达到抑制HNF1B转录的作用,从而抑制HNF1B蛋白的表达。进一步通过WB检测该蛋白的表达,发现miR-802的过表达使该基因下调约2倍(Fig9,Table3),提示HNF1B很可能是miR-802调控糖代谢的重要靶点。第三部分MiR-802通过HNF1B对高脂喂养小鼠肝脏胰岛素抵抗及糖代谢的调节机制目的:在高脂诱导IR小鼠模型上,通过转染腺相关病毒(adeno-associated viral,AAV)调节 miR-802 的表达,体内观察 miR-802 的上/下调对其靶基因HNF1和PI3K-AKT信号通路的影响,同时检测该通路上游基因和下游糖代谢通路上关键酶的表达,揭示miR-802-HNFlB这一信号通路体内调控胰岛素抵抗和糖代谢的潜在机制。方法:5周龄C57BL/6J小鼠适应性喂养一周后随机分为2组:对照组(Normal diet,ND)14 只,高脂组(high fat diet,HFD)60 只。对照组给予普通饲料D12450B喂养,热量组成:碳水化合物70%,蛋白质20%,脂肪10%,总热量为385 kal/100g。高脂组给予高脂饮食D12492喂养,热量组成:碳水化合物20%,蛋白质20%,脂肪60%,总热量为524 kal/100g。每日记录摄食量,每周记录两次空腹体重,于高脂喂养12周后测空腹及进食后血糖变化。每组随机选6只小鼠行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),并留尾静脉血清测胰岛素水平,计算QUICKI值和葡萄糖曲线下面积(AUCglu);随后每组随机选择5只小鼠,处死后留取血及肝脏标本。高脂诱导IR小鼠模型造模成功后,高脂模型组通过转染miR-802的腺相关病毒来调节肝脏miR-802的表达,分为五组:单纯高脂饮食组(High-fat diet,HFD)、高脂饮食+miR-802 过表达组(miR-802)、高脂饮食+miR-802过表达对照组(GFP)、高脂饮食+miR-802敲低组(AAV-Sponge,miR-802-SP)、高脂饮食+miR-802敲低阴性对照组(AAV-Negative Control,NC))。注射腺相关病4 周后行 IPGTT 试验,留取空腹尾静脉血清测胰岛素水平,并计算QUICKI值和AUCglu。随后全部处死小鼠,留取血清及肝脏标本,测定TC和TG,通过实时荧光定量PCR技术检测各组小鼠肝脏miR-802的表达,胰岛素信号通路IRS-2、PI3K 和 AKT,及 G6PC、SOCS3 的 mRNA 水平。应用 Western blot 技术检测IRS-2和AKT总蛋白及磷酸化水平及PI3K和靶基因HNF1B蛋白表达的变化。应用试剂盒测定各组小鼠肝脏糖原含量、GK活性和PEPCK活性。HE染色观察小鼠肝脏形态变化。结果:1高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠模型的建立高脂饮食喂养12周后,HFD组小鼠体重高于ND组(P<0.05);HFD组FBG水平较ND组略升高,但差异无统计学意义(P>0.05),进食后血糖HFD组高于ND组,(P<0.01);HFD组小鼠空腹血清INS、TC及TG水平高于ND组,差异有统计学意义(P<0.05)。IPGTT结果示:HFD组15,、30’、60’血糖均较ND组升高(P<0.05),HFD组AUCglu也显著升高(P<0.05)。与ND组相比,HFD组定量胰岛素敏感性指数(Quantitative Insulin Sensitivity Check Index,QUICKI=1/[log(I0)+log(G0)])值明显降低(P<0.05)。2转染腺相关病毒后各组小鼠肝脏miR-802的mRNA水平比较与ND组相比,HFD组小鼠肝脏miR-802的mRNA水平明显升高(P<0.05),转染AAV后4周后,miR-802组肝脏miR-802的mRNA水平较对照GFP组明显升高(P<0.05);miR-802-SP组肝脏miR-802的mRNA水平较对照NC组明显降低(P<0.05);且在荧光显微镜下可以看到肝脏切片绿色荧光的表达,提示AAV转染成功。3转染腺相关病毒后胰岛素敏感性相关指标的变化3.1各组小鼠一般指标的变化注射AAV使miR-802的表达量升高或者降低后,各干预组小鼠的体重及摄食量与HFD组相比无统计学差异(P>0.05)。给予AAV转染上调/下调miR-802的表达量后,miR-802组的INS和TG较对照GFP组升高;miR-802-SP组的INS和TG较对照NC组降低(P<0.05);然而各干预组间血清TC水平变化无统计学意义(P>0.05)。3.2各组小鼠胰岛素敏感性比较IPGTT结果示:HFD组15’、30’、60’血糖均较ND组升高(P<0.05),上调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802组30’血糖较对照GFP组升高(P<0.05);15’、60’、120’血糖均较对照GFP组升高(P>0.05)。下调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组0’、30’血糖较对照NC组降低(P>0.05)。HFD组AUCglu高于ND组,而QUICKI值较ND组明显降低(P<0.05);上调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802组AUCglu高于对照GFP组,而QUICKI值较对照GFP组降低(P<0.05);下调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组AUCglu较对照NC组降低,QUICKI值较对照NC组升高(P<0.05)。提示高脂组小鼠发生胰岛素抵抗,上调/下调肝脏miR-802表达后可影响胰岛素敏感性。4 PI3K-AKT通路的变化4.1 PI3K-AKT通路上关键基因的mRNA表达比较与ND组相比,HFD组小鼠IRS-2、PI3K和AKT的mRNA表达下降(P<0.05);上调小鼠肝脏miR-802表达后,PI3K的mRNA表达较GFP组下降(P<0.05),下调小鼠肝脏miR-802表达后,PI3K的mRNA表达较NC组升高。无论上调或者下调miR-802的表达,IRS-2和AKT的mRNA表达无明显变化。4.2 PI3K-AKT信号通路的蛋白水平变化与对照ND组相比,HFD组小鼠肝脏的P-IRS-2/IRS-2的比值升高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值降低;上调肝脏miR-802表达后,p-IRS-2/IRS-2 的比值较对照GFP组升高,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 的比值降低,提示胰岛素敏感性下降;下调肝脏miR-802表达后,p-IRS-2/IRS-2的比值较对照NC组降低,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值升高(P<0.05),提示下调肝脏miR-802的表达后改善了肝脏胰岛素的敏感性。5 MiR-802靶基因HNF1B蛋白表达的变化与对照ND组相比,HFD组小鼠HNF1B蛋白水平降低;上调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802组HNF1B蛋白表达较GFP组明显降低(P<0.05);下调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组HNF1B蛋白表达较NC组明显升高;支持HNF1B是miR-802的靶基因。6肝脏糖代谢相关指标的变化6.1肝脏糖原含量的变化与对照ND组相比,HFD组小鼠肝脏糖原含量降低;上调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802组小鼠肝脏糖原含量较对照GFP组降低(P<0.05);下调小鼠肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组小鼠肝脏糖原含量较对照NC组升高(P<0.05)。6.2肝脏GK和PEPCK活性与对照ND组相比,HFD组小鼠肝脏GK活性降低,PEPCK活性升高;上调肝脏miR-802表达后,miR-802组小鼠肝脏GK活性较对照GFP组降低(P<0.05),PEPCK活性较对照GFP组明显升高(P<0.05);下调肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组小鼠肝脏GK活性较对照NC组升高(P<0.05),PEPCK活性较对照NC组明显降低(P<0.05)。提示高脂饮食时肝脏糖异生增加,糖酵解减少,上调/下调肝脏miR-802表达后可影响肝脏糖代谢。6.3各组小鼠G6PC和SOCS3的mRNA水平比较与对照ND组相比,HFD组小鼠肝脏G6PC和SOCS3的mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);上调肝脏miR-802表达后,miR-802组小鼠肝脏G6PC和SOCS3的mRNA水平较对照GFP组升高(P<0.05);下调肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组小鼠肝脏G6PC和SOCS3的mRNA水平较对照NC组降低(P<0.05)。7肝脏组织形态学比较ND组肝组织结构完整,肝小叶规则,肝细胞排列整齐,在中央静脉周围呈放射状分布,肝细胞中央有大而圆的核,细胞质均匀,未见脂滴和炎症细胞侵润;HFD组小鼠肝小叶结构紊乱,肝细胞肿胀,肝细胞胞浆内可见脂滴空泡,且可见小叶内及汇管区炎症细胞侵润;上调肝脏miR-802表达后,miR-802组可见肝小叶结构明显紊乱,肝细胞索消失,肝细胞变大,肝细胞胞浆内可见大量圆形脂滴空泡,重者胞质疏松呈网状改变,且小叶内炎细胞侵润程度较对照GFP组增加。上调肝脏miR-802表达后,miR-802-SP组小鼠肝脏可见肝细胞体积较对照NC组变小,胞浆内脂滴减少,小叶内炎细胞侵润程度较对照组有所缓解。结论:1在细胞和动物水平验证了IR模型中miR-802的表达升高,并且与胰岛素抵抗和糖代谢异常有关。。2在IR细胞模型上,通过表达谱芯片和靶基因预测软件筛选出miR-802的潜在靶点HNF1B,进一步的功能富集分析提示miR-802可能通过该靶点调节PI3K-AKT信号通路,进而影响肝脏胰岛素敏感性和糖代谢。3在高脂诱导IR的小鼠模型上进一步验证了miR-802-HNF1B这一通路对PI3K-AKT的调节作用,从动物水平说明了miR-802在调节肝脏胰岛素敏感性和糖代谢方面的重要意义。