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蜕皮激素是调控昆虫蜕皮与变态发育的重要激素,其合成主要由Halloween基因家族编码的细胞色素P450氧化酶基因参与,包括CYP307A1(Spook,Spo)、CYP306A1(Phantom,Phm)、CYP302A1(Disembodied,Dib)、CYP315A1(Shadow,Sad)、CYP314A1(Shade,Shd),并与蜕皮激素受体共同发挥作用。以蜕皮激素调控基因为靶标,应用RNAi防控害虫正逐步成为研究热点,并为新农药的开发提供理论依据。朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus是一种世界性分布的重要农业经济害螨,其发育过程包括卵、幼螨、若螨、成螨,每个发育阶段都会蜕皮。目前对朱砂叶螨蜕皮激素合成的分子机理尚不清楚;本文以朱砂叶螨作为研究对象,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;在此基础上运用RT-qPCR技术探讨了这些基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的mRNA表达模式;测定了环虫酰肼对朱砂叶螨的毒性,研究了环虫酰肼处理后朱砂叶螨Halloween基因以及核受体基因的mRNA表达水平。研究结果如下:一、朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因序列的生物信息学分析本文首次克隆获得朱砂叶螨3个Halloween基因和1个核受体基因,分别命名为TcDib、TcSad、TcShd、TcEcR。TcDib(GenBank 登录号为 MN011166)全长为2201bp,其中开放阅读框(ORF)长1560 bp,编码519 aa,分子质量约为59.315 kDa,理论等电点 pI 为 8.9。TcSad(GenBank 登录号为 MN807301),开放阅读框(ORF)为1965bp,编码654 aa,分子质量约为74.58 kDa,理论等电点pI为8.69。TcShd(GenB ank登录号为MN807300)全长为2354bp,开放阅读框(ORF)为1446 bp,编码481 aa,分子质量约为54.68 kDa,理论等电点pI为9.0。TcEcR(GenBank登录号为MN011167)全长为3937bp,开放阅读框(ORF)长为1650 bp,编码549 aa,分子质量约为61.91 kDa,理论等电点pI为7.7。对这些基因的保守结构域进行分析发现:朱砂叶螨3个Halloween基因TcDib、TcSad、TcShd都具有典型的 P450 结构域:WxxR(Helix-C)、P/IPGPxG/PxP(PERF motif)、ExxR(Helix-K)、A/GGxE/DTT/S(Helix-I)和血红素结合域PFxxGxRxCxG/A;核受体基因TcEcR具有典型的DNA结合域(DBD)以及配体结合域(LBD)。同源性比对分析后发现这些基因与其它物种该基因的相关序列高度保守;基于氨基酸序列的系统发育研究表明朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因编码的氨基酸序列与其他昆虫和螨中相应的同源序列聚类在一起,且均与同属于叶螨科的二斑叶螨和柑橘全爪螨亲缘关系最近。二、朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因的发育特异性表达模式本文采用实时荧光定量技术探讨了Halloween基因和核受体基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段(卵,幼螨,若螨以及成螨)的mRNA表达模式。实验结果发现在每个发育阶段这些基因都会表达,但表达水平存在一定的差异,Halloween基因TcDib、TcSad、TcShd分别在一若第二天、雌成螨、二若第二天表达量最高,核受体基因TcEcR和TcRXR1在二若第二天、TcRXR2在一若第二天表达量最高;在蜕皮前这些基因的表达量增加,而蜕皮后基因的表达量下降,推测这些基因可能与朱砂叶螨的蜕皮有关。另外,发现这些基因在雌成螨中的表达量普遍高于雄成螨,说明蜕皮激素还可能与雌虫的繁殖有关。三、环虫酰肼对朱砂叶螨的毒性及对Halloween基因和核受体基因mRNA表达的影响本文使用不同浓度的环虫酰肼溶液对朱砂叶螨幼螨进行了生物测定,得出其LC50的值为52.75 mg/L。然后用不同浓度(LC10、LC30、LC50、LC70)的药剂处理朱砂叶螨幼螨后,对其蜕皮率、死亡率、蜕皮时长进行分析并采用试剂盒对机体内蜕皮激素的含量进行了测定。实验结果发现朱砂叶螨幼螨的蜕皮率、死亡率、蜕皮时长以及蜕皮激素的含量会随着药剂浓度的变化而发生变化。随着药剂浓度的升高,蜕皮率增加;随着药剂浓度的升高,死亡率升高,LC70处理组比对照组升高65.6%;随着药剂浓度的升高,蜕皮时长缩短,LC70处理组为对照组的0.8倍;朱砂叶螨幼螨机体蜕皮激素的含量随着药剂浓度的升高而升高,LC70处理组为对照组的1.62倍。说明环虫酰肼影响朱砂叶螨的蜕皮过程。在分子水平上,采用RT-qPCR技术检测了药剂处理后Halloween基因(TcDib、TcSad、TcShd)和核受体基因(TcEcR、TcRXR1、TcRXR2)的mRNA表达水平。结果发现,不同浓度环虫酰肼处理朱砂叶螨幼螨后参与蜕皮激素合成的Halloween基因表达量均增加。LC30处理组TcDib的mRNA表达量是对照组的1.76倍;LC10处理组TcSad的mRNA表达量是对照组的1.54倍;LC70处理组TcShd的mRNA表达量是对照组的1.77倍。不同浓度环虫酰肼处理朱砂叶螨幼螨后核受体基因表达量均增加,LC30处理组TcEcR的mRNA表达量为对照组的2.69倍;LC50处理组TcRXR1和TcRXR2的mRNA表达量分别为对照组的3.24和3.02倍。说明环虫酰肼诱发调节朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因的转录。综上所述,本文对朱砂叶螨Halloween基因和核受体基因的序列特征进行分析并探讨了这些基因的mRNA表达模式,为后续这些基因的功能分析奠定了基础,也为利用这些基因作为靶标防控朱砂叶螨提供了一定的理论依据。