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一个理想的艾滋病疫苗应该既能诱导产生中和抗体又能诱导细胞调节免疫,而实现这个目标最有效的办法是基于重组病毒载体的异源性Prime-Boost策略。重组嵌合腺病毒（Ad5/35-HGEC）和重组修饰型痘苗病毒安卡拉（MVA-HGEC）正是基于此目的而构建的,两种重组病毒载体均携带优化了的HIV-1 C亚型gag和gp160基因,采用Prime-Boost策略,Ad5/35-HGEC用于初免,MVA-HGEC用于加强,以期在诱导产生CTL应答的同时产生抗HIV特异性中和抗体,实现对HIV感染的有效治疗。本文在前期工作的基础上,分别进行了重组病毒载体的遗传稳定性及其在动物体内的生物分布研究,并对重组病毒载体采用Prime-Boost策略接种恒河猴后体液免疫进行评价。主要包括以下四个部分:第一章:Ad5/35-HGEC与MVA-HGEC的遗传稳定性研究在本章中,我们分别验证了基因序列的忠实性和蛋白表达的稳定性,为后续实验的开展提供重要参考。首先,我们利用PCR技术分别扩增各代次病毒载体中目的基因gag和gp160序列全长并测序。检测结果显示从第5代传至第20代,在两种病毒载体中目的基因的序列忠实性良好,测序结果没有发现插入或者缺失突变。其次,将不同代次的重组病毒载体Ad5/35-HGEC和MVA-HGEC分别感染293细胞后收集细胞并提取蛋白,通过Western blot检测目的蛋白的表达情况。检测结果显示各代次重组病毒载体分别感染293细胞后均能检测到目的蛋白gag与gp160,而空载体对照组中未检测到目的蛋白,表明了这两种病毒载体传至第20代后仍能够有效表达目的蛋白,而且蛋白表达水平没有明显差异。另外,我们通过PCR技术检测具有复制能力腺病毒（RCA）的保守区基因E1a,评价Ad5/35-HGEC在293细胞多次传代后RCA的产生情况。检测结果显示,Ad5/35-HGEC传至20代次均未产生RCA。在本章中,我们按照我国新生物制品临床前药代动力学研究要求,研究了重组病毒载体Ad5/35-HGEC和MVA-HGEC的生物分布情况,考查重组病毒载体Balb/c小鼠肌肉注射后在体内注射部位和重要组织器官的分布及随时间的变化,为其临床研究给药方案设计和优化提供有力的理论依据。我们首先建立了基于TaqMan探针的实时定量PCR检测方法,并进行了方法学验证。结果显示,该方法特异性好、灵敏度高、重复性好,符合生物制品检测的方法学要求。生物分布研究结果显示,Balb/c小鼠肌肉注射1.6×109vp Ad5/35-HGEC后,重组病毒载体主要分布在注射部位肌肉组织中,肝脏、心脏和肺脏中有少量分布,其余组织器官仅有微量或者没有分布,血液中仅第一周能检测到微量的残留,而后基本检测不到目的基因。给药一周时注射部位肌肉组织中测得的Ad5/35和gag浓度分别为4332.6±2562.9 copies（?）mg-1和1472.3±1053.8copies（?）mg-1;八周后各组织器官中已经基本检测不到病毒DNA。Balb/c小鼠肌肉注射2×107pfu MVA-HGEC后,重组病毒载体也主要分布在注射部位肌肉组织中,血液和其他组织器官中仅有微量或者没有分布,而且MVA-HGEC的清除速度明显快于Ad5/35-HGEC,给药0.5小时后注射部位肌肉组织中测得的MVA和gag浓度分别为859.5±257.2 copies（?）mg-1和1120.6±713.7 copies（?）mg-1;72小时后各组织器官中已检测不到病毒DNA。此外,本研究通过提取注射部位肌肉和生殖腺总DNA,检测其中病毒DNA载量的变化趋势,验证是否产生插入突变和生殖遗传毒性。检测结果显示,两种病毒载体在肌肉组织中的浓度均快速下降,后期均已检测不到病毒DNA,而在生殖腺中病毒载体基本没有分布,表明了重组病毒载体肌肉注射后发生插入突变或者生殖遗传的可能性较小。第三章:利用活体成像技术研究Ad5/35-Luc的表达分布与代谢为了更加直观地描述重组病毒载体在生物体内的表达分布与代谢情况,本研究引入了活体生物发光成像技术,动态监测目的基因的表达分布与代谢。将重组腺病毒载体Ad5/35用萤火虫荧光素酶基因标记,构建Ad5/35-Luc,以肌肉注射方式接种Balb/c小鼠,给药剂量为2×1010vp,分别在给药后1,3,7,10,14,21,28和35天观察荧光素酶的表达情况。检测结果显示,荧光素酶主第二章:利用实时定量PCR技术研究Ad5/35-HGEC/MVA-HGEC的生物分布要在注射部位表达,表达量在第7天左右达到峰值,而后开始缓慢下降,最长可以检测到给药后第28天,其他组织和器官未检测到生物发光,说明了Ad5/35-Luc主要在注射部位表达并代谢,与实时定量PCR检测方法得出的结果相一致。第四章:Ad5/35-HGEC初免– MVA-HGEC加强策略的体液免疫研究为确证重组病毒载体在体内能够有效表达目的蛋白并诱导产生抗HIV特异性抗体,本研究采用Prime-Boost策略将重组病毒载体接种恒河猴,采用ELISA方法检测恒河猴在疫苗注射后抗HIV-1 C p24特异性抗体的表达及其变化趋势。我们选择HIV-1 C血清学反应阴性恒河猴作为实验动物,设立生理盐水对照组、空病毒载体对照组和复合重组病毒载体组。将生理盐水对照组样品检测结果求平均值（Mean）和标准差（Std）,CO （cut-off）值定义为超过平均值3倍标准差（CO=Mean+3 Std）,求得CO=0.389,OD450/CO≥1.0视为阳性结果。检测结果显示,恒河猴肌肉注射Ad5/35-HGEC 1×1011vp后大约1周左右即可产生低水平的抗HIV-1 C p24特异性抗体,在第6周左右抗体浓度达到峰值（OD450=0.857±0.230）;第8周用108pfu MVA-HGEC加强免疫,第12周左右抗体浓度再次达到峰值,且比初次免疫有显著提高（OD450=1.025±0.123）,说明了Prime-Boost策略能够有效提高体液免疫水平。从给药后第2周到第19周,复合重组病毒载体免疫组与生理盐水对照组检测结果统计分析具有显著差异,第22周仍有两只恒河猴血清抗HIV-1 C p24特异性抗体检测结果呈阳性。空载体对照组检测得到的OD450均值小于CO值,判定为阴性,说明没有产生抗体。为了进一步判定产生抗体强度,将病毒载体免疫组恒河猴血清样品稀释50倍后进行检测,结果均为阴性。由此推断复合重组病毒载体免疫恒河猴能够产生抗HIV-1 C p24特异性抗体但是滴度较低（<1:50）,为达到更好的体液免疫效果需要对免疫方案进行优化。总之,本研究中的两种重组病毒载体具有良好的遗传稳定性,在动物体内的生物分布没有明显的靶向性,发生插入突变或生殖遗传的可能性较小,体液免疫评价显示了其能有效诱导产生抗HIV特异性抗体。基于这两种重组病毒载体的Prime-Boost策略将为HIV疫苗研究提供一个新的思路。