目的：乙型肝炎病毒(HBV)的分子生物学研究表明，共价闭合环状DNA(cccDNA)对HBV感染的建立及HBV复制具有非常重要的意义，在慢性乙型肝炎HBV感染状态持续存在，抗病毒治疗停止后病情反复及HBV耐药等方面，cccDNA发挥了关键作用。目前人们对HBVcccDNA的研究大多来自动物模型和细胞模型。实验动物主要有东方土拨鼠、鸭和转基因小鼠。对人体内HBVcccDNA的了解非常少。目前国内没有慢性乙型肝炎患者肝组织HBVcccDNA定量研究在治疗观察中的作用的报道。本课题应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织HBVcccDNA定量，研究肝组织HBVcccDNA定量与肝组织及血清HBVDNA定量、HBsAg滴度、肝组织损害程度及肝组织病理的关系，探讨HBVcccDNA在慢性乙型肝炎各个时期的分布特点，研究肝组织HBVcccDNA的动力学变化、肝组织HBVcccDNA的定量研究在慢性乙型肝炎诊断和治疗中的意义，为慢性乙型肝炎临床诊断和治疗提供可靠依据。方法：患者共96例，其中85例慢性乙型肝炎患者均来自山东省立医院2005年5月～2006年10月住院病人，男65例，女20例，年龄21～54岁，平均32岁。所有患者诊断均符合中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会2000年9月西安联合修订的《病毒性肝炎防治方案》，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致肝损害。所有病例院外半年内未行抗病毒治疗，根据HBeAg和抗-HBe的情况，分为HBeAg阳性的慢性乙型肝炎和HBeAg阴性的慢性乙型肝炎两组，两组资料在年龄、性别、病程等方面均具有可比性。非乙肝患者11例，包括：丙肝2例，自身免疫性肝炎1例，脂肪肝4例，酒精性脂肪肝2例，不明原因肝损害2例作为对照。应用lightcycler荧光PCR检测仪检测肝组织HBVcccDNA定量与肝组织及血清HBVDNA定量，美国BECKMANCX9全自动生化分析仪及配套试剂分别检测ALB、ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL等肝功能指标，以ALT、TBIL为代表进行分析，Roche公司ECL2010全自动电化学发光免疫分析仪检测HBsAg滴度，进行肝组织炎症活动度(G)分级及肝组织纤维化程度(S)分期等，进行统计学分析。结果：1．85例慢性乙型肝炎患者肝组织均检测到HBVcccDNA，定量为1.45×10~3拷贝／mg～3.14×10~6拷贝／mg(对数值：4.54±1.32)；肝组织HBVDNA，定量为3.21×10~4拷贝／mg～2.35×10~7拷贝／mg(对数值：4.90±1.33)；血清HBVDNA，定量为3.92×10~4拷贝／ml～5.53×10~8拷贝／ml(对数值：5.10±1.34)。2．肝组织HBVcccDNA定量与肝组织、血清HBVDNA定量的相关性：肝组织HBVcccDNA定量与肝组织HBVDNA定量呈高度相关(对数值：4.54±1.32与4.90±1.33，r=0.738，p＜0.001)；肝组织HBVcccDNA定量与血清HBVDNA定量也正相关(对数值：454±1.32与5.10±1.34，r=0.436，p＜0.005)。3．肝组织HBVcccDNA定量与血清HBsAg滴度的关系：血清HBsAg滴度平均值769±211.32COI。肝组织HBVcccDNA定量与血清HBsAg滴度呈正相关(r=0.721，p＜0.005)。4．HBeAg阳性的慢性乙型肝炎和HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者肝组织HBVcccDNA定量、肝组织HBVDNA定量和血清HBVDNA定量结果见表1，HBeAg阳性组肝组织HBVcccDNA定量、肝组织HBVDNA定量和血清HBVDNA定量均高于HBeAg阴性组，两者各项结果之间比较均有显著性差异(p＜0.05)。5．肝组织HBVcccDNA定量与肝组织实质损害指标血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、血浆凝血酶原时间PT)的关系，见表2。由表2可以看出HBeAg阳性的慢性乙型肝炎和HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者之间ALT、TBIL、PT均无显著差异(p＞0.05)说明肝组织HBVcccDNA与肝功能检测结果无相关性，不能反映肝组织实质损害的程度。6．肝组织HBVcccDNA定量与肝组织病理的关系：肝组织HBVcccDNA定量与肝组织炎症活动度(G)及肝组织纤维化程度(S)的关系，见表3。85例慢性乙型肝炎患者肝组织HBVcccDNA定量10~3拷贝／mg～10~6拷贝／mg之间。肝组织病理学检查结果显示，炎症活动度1～3，纤维化程度0～3。两者无明显相关性，说明肝组织HBVcccDNA定量与肝组织炎症及纤维化程度无明显相关关系。7．其中45例HBeAg阳性病人应用拉米夫定治疗48周后，再次接受各种检查。发现18例HBeAg转阴，转阴率为42％，27例HBeAg阳性病人检查结果未发生变化。治疗前后血清HBeAg与肝组织HBVcccDNA、肝组织HBVDNA、血清HBVDNA的关系见附表4。治疗前后血清HBeAg与血清学指标的关系附表5。结论：1：肝组织HBVcccDNA定量水平准确，直接反映了体内HBV存在和复制状态，与目前临床指标血清HBVDNA定量、HBeAg相比较，更加可靠灵敏。特别在血清HBVDNA定量低于检测水平以下时，是评价HBV复制、感染持续、临床药物抗HBV疗效或临床痊愈的最重要指标。2：慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织的HBVcccDNA与血清HBVDNA定量呈正相关，在临床工作中动态检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA定量，在一定程度上能反映肝组织HBV的复制程度。帮助了解肝组织的HBVcccDNA定量的变化，作为抗病毒治疗的适应症选择和临床疗效判断的依据。但慢性乙型肝炎(CHB患者血清HBVDNA定量的水平和肝组织的HBVcccDNA相关性不太强，血清HBVDNA定量的水平与肝组织HBV的复制程度并非平行变化，有时不能真实反映肝组织HBV感染及HBVDNA复制情况，不能通过血清HBVDNA定量推测肝组织的HBVcccDNA定量的水平，特别在血清HBVDNA定量低于检测水平以下时，肝组织HBVDNA仍可维持一定水平。3：肝组织HBVcccDNA定量与血清HBsAg滴度相关性较强，血清HBsAg滴度可在一定程度上反应肝组织HBVcccDNA定量的状况。但在隐匿性HBV感染诊断，仍需采用检测肝组织HBVcccDNA定量来明确诊断。4：HBeAg阳性患者组肝组织HBVcccDNA定量、肝组织HBVDNA定量和血清HBVDNA定量均高于HBeAg阴性患者组。说明HBeAg也是病毒在体内复制的指标之一。抗HBe阳性表示病毒复制减弱，传染性降低，但抗HBe阳性的病例肝组织仍可发现HBVcccDNA、HBVDNA。具有较强传染性和较高的病毒复制，肝损害持续存在，仍具有慢性化进展倾向。5：慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织HBVcccDNA定量在病理炎症分级(G)和纤维化分期(S)的各组间均无显著性差异，与肝实质损害程度无关，肝组织HBVcccDNA定量不能预测CHB肝组织病变程度。细胞因子引起非细胞溶解机制在清除肝组织HBVcccDNA中起部分作用。6：在应用拉米夫定治疗48周后，拉米夫定对肝组织HBVcccDNA无任何作用；对肝组织HBVDNA及血清HBVDNA抑制作用较强：在应用拉米夫定治疗48周后，肝组织HBVcccDNA仍可维持一定水平(特别在血清HBVDNA定量低于检测水平以下时)，说明血清HBVDNA定量水平与肝组织HBV的复制程度并非平行变化，不能真实反映肝组织HBV感染及HBVDNA复制情况，不能通过血清HBVDNA定量推测肝组织的HBVcccDNA定量水平。进一步证实了结论27：在应用拉米夫定治疗48周后，拉米夫定对HBeAg转阴组的血清ALT治疗效果较好；对HBeAg持续阳性的血清ALT治疗效果不理想；拉米夫定对血清TBIL有一定程度作用：拉米夫定对血清PT基本无影响。本组45例HBeAg阳性病人治疗后18例HBeAg转阴，本组45例HBeAg阳性病人治疗后18例HBeAg转阴，由于病例数较少，样本较小，意义不大。