含锶交联藻酸钠凝胶对前成骨细胞黏附和增殖的影响

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目的:利用氯化锶作为交联剂合成含锶交联新型藻酸凝胶,检测含锶藻酸凝胶的理化性质,并检测小鼠MC3T3-E1细胞于含锶交联藻酸凝胶中的黏附、增殖情况;提出利用氯化锶作为交联剂改善凝胶生物性能,为藻酸盐可注射组织工程支架提供理论依据。方法:用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒分析海藻酸盐溶液的细胞毒性,按钙离子和锶离子质量比例分别为A(4:0)B(3:1)C(2:2)D(1:3)E(0:4)制备5组终浓度均为4 g/L的电解液(其中A组为对照组),配置终浓度为2%wt的藻酸钠溶液,pH调至7.4,将5组复合前体溶液,高温高压灭菌,并与等量海藻酸钠混合,通过特定方法分别制备出5组直径为1 cm的凝胶圆盘。检测各组凝胶在双蒸水和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的溶胀率,检测凝胶的压缩模量,用扫描电镜(SEM)观察各组凝胶的微观结构,并在第1、2、3天收集浸出液,通过电感耦合等离子体光谱仪(ICP)检测溶液中锶离子的析出浓度。取小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞株为种子细胞,接种于各组凝胶表面,接种1天后行超高分辨扫描电镜观察细胞黏附形态,于接种第1、2、3天的同一时段,分别采用二乙酸荧光素/典化丙啶(FDA及PI)染色,观察细胞在凝胶表面的增殖活性,行活死细胞计数,计算细胞存活率。实验采用GraphPad Prism 6.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞毒性检测结果表明,本实验所使用的海藻酸钠粉末生物相容性良好,可用作后续的实验研究。藻酸盐凝胶在双蒸水及磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的溶胀率随锶离子浓度增高而增大,与对照组相比均有统计学意义(P<0.05);扫描电镜结果显示,随着锶离子浓度的增加,凝胶的孔隙逐渐增大,C组凝胶孔隙均匀且均一,D和E组显示凝胶纤维网络松散,孔隙较不均匀;压缩模量结果显示随着锶离子浓度提高,C组凝胶强度最大,随着锶离子浓度的继续增加,凝胶强度呈现下降趋势,但均高于对照组凝胶的强度;ICP结果显示,各组溶液的锶离子浓度逐渐降低,释放到溶液中的锶离子的量下降并且与最初引入凝胶中的总锶离子成正比;可以看出A、B、C组伸展数量较多,其中,C组黏附情况较为良好,数量最多;显微镜及FDA/PI染色均发现种子细胞在C组凝胶表面的增殖具有明显的改善;细胞接种第3天,各组细胞活、死、及存活率结果显示,C组存活率最高,E组存活率最低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:相比对照组,随着锶离子浓度增高,凝胶机械强度提高,溶胀率增大,其中C组对细胞的粘附和增殖具有更显著的促进作用。因此,掺入等比例锶离子形成的复合凝胶为新型可注射骨组织工程支架提供理论基础。
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