论文部分内容阅读
目的及意义睾丸生殖细胞瘤(testicular germ cell tumors,TGCT)是中青年男性中最常见的恶性肿瘤,近年来,其发病率呈上升趋势。畸胎癌(Teratocarcinoma)是一种较常见的TGCT,好发于新生儿和婴幼儿,其恶性程度随年龄增长而增高。畸胎癌中除含有分化的三胚层来源的组织外,还含有未分化的胚胎癌细胞(Embryonic carcinoma cells,EC)。分离EC细胞,重新进行小鼠皮下或腹腔注射,可产生新的畸胎癌。这表明畸胎癌可来源于EC细胞。因此研究调控EC细胞增殖和分化的分子机制,对于了解畸胎癌的发生机制有重要意义。EC细胞是一类具有多分化潜能和自我复制能力的干细胞,可在体外无限增殖形成永生的细胞系,如小鼠的EC细胞系P19。在一定诱导条件下,EC细胞可分化为三胚层来源的各种细胞。EC细胞自我更新和分化的分子机制尚不完全清楚。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号转导通路中的经典通路,不仅参与正常细胞和干细胞的增殖和分化,而且与肿瘤的发生密切相关。探讨Wnt/β-catenin在EC增殖和分化中的作用和作用机制,不仅有助于阐明畸胎癌形成的分子调控机制,而且能为畸胎癌及相关生殖细胞肿瘤的基因靶向治疗提供有效的实验依据。目前,关于Wnt/β-catenin信号通路在畸胎癌中作用及其机制的研究在国内外少有文献报道。本研究对小鼠畸胎癌细胞系P19细胞进行体外培养,通过免疫荧光染色、BrdU标记、MTT比色、RT-PCR及Western blotting等方法检测胚胎癌干细胞标志性基因的表达及其变化规律。从而深入探讨Wnt/β-catenin信号通路在胚胎癌细胞增殖中的作用,并初步探讨其可能的作用机制,为将来的基因诊断与基因治疗提供有力的实验与理论依据。研究方法1.P19细胞体外传代培养将细胞分为四组,分别为：正常对照组(Con组),添加SB216763组(SB组),添加全反式维甲酸(all trans-RA)组(RA组)和添加SB216763与all trans-RA组(SB+RA组)。培养2d时,通过免疫荧光双标染色,检测Oct4/β-catenin基因在四组细胞中的表达及其变化规律。2.细胞培养3d时,通过BrdU标记,比较四组细胞间增殖情况；通过MTT比色,比较四组细胞间存活率的差异。3.细胞培养1d时,通过RT-PCR法检测四组中Oct4、β-catenin等基因mRNA水平的表达及变化规律；通过Western blotting法,检测四组中Oct4蛋白水平的表达及变化规律。4.细胞培养2d及7d时,通过免疫荧光染色、RT-PCR及Western blotting等方法检测C-myc基因于四组中的表达及变化规律。结果1.免疫荧光双标染色结果显示,Con和RA组β-catenin主要分布于胞质,核内分布较少；SB组和SB+RA组β-catenin主要分布于细胞核。RA组Oct4表达较其它三组均明显减少。SB组和SB+RA组β-catenin入核的细胞数和核内Oct4分布明显多于对照组和RA组。2. BrdU标记结果显示,RA组BrdU标记细胞较对照组少,SB组和SB+RA组BrdU标记细胞明显多于对照组,差异有显著意义(P<0.05)。MTT结果显示,RA组OD值低于对照组,SB组和SB+RA组OD值明显高于对照组,差异有显著意义(P<0.05)；SB组和SB+RA组之间差异无显著意义。3. RT-PCR结果显示,RA组Oct4 mRNA水平明显低于对照组,SB组和SB+RA组Oct4 mRNA水平高于对照组；Sox2 mRNA水平在各组之间的差异类似于Oct4；Nanog和Stat3在四组之间差异不明显；Western blotting结果显示,RA组Oct4蛋白水平明显低于对照组,SB组和SB+RA组Oct4蛋白水平高于对照组。4.培养2d和7d的免疫荧光染色结果显示,SB组和SB+RA组C-myc核内表达明显高于正常对照组和RA组。RT-PCR和Western blotting结果显示,RA组C-myc基因表达低于对照组,SB组和SB+RA组C-myc基因表达高于对照组,SB组和SB+RA组两组之间无明显差异。结论分析以上实验结果,我们得出以下结论：1.Wnt/β-catenin信号通路的激活促进P19细胞中Oct4的表达,抑制RA诱导的细胞分化。2.Wnt/β-catenin信号通路的激活能促进P19细胞增殖并提高细胞存活率。3.Wnt/β-catenin信号通路可能通过上调靶基因C-myc的表达,从而促进P19细胞增殖。