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蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerases,PDIs）家族属于硫氧还原蛋白超家族,与该家族具有相似的活性结构位点CXXC,并且具有氧化、还原和异构二硫键的活性及分子伴侣功能。目前人们已发现20多个PDI家族成员,其中PDI（PDIA1）是该家族的原型蛋白。我们的前期实验发现,PDI在背根神经节（Dorsal root ganglia,DRG）中有较高水平表达。DRG神经元是躯体感觉初级传入神经元,是痛觉信号产生的起始部位和疼痛传导的重要部位。有研究发现,CFA（完全弗氏佐剂,complete Freund’s adjuvant）慢性炎性疼痛模型小鼠的DRG中蛋白二硫键异构酶PDIA1、PDIA3（ERp57）、PDIA6显著上调,而腹腔注射PDI抑制剂PACMA31可以恢复小鼠机械刺痛阈值。这一结果提示DRG中的PDI可能在疼痛的发生过程中起重要作用。为了证实这一假设,我们首先拟使用Cre-loxP重组酶系统,特异性地将表达Nav1.8电压依赖性钠离子通道的痛觉相关DRG神经元（nociceptors）中的PDI敲除,并观察敲除小鼠基础痛域、急性炎性疼痛（右后脚掌注射缓激肽,bradykinin-BK）和慢性炎性疼痛（右后脚掌注射完全弗氏佐剂CFA）的疼痛行为学改变。已知DRG神经元所表达的多种离子通道是其产生兴奋性和疼痛信号的基础,已有文献报道蛋白二硫键异构酶PDI对某些离子通道功能有调节作用。如有报道称PDI可增加红细胞Gardos通道（钙激活小电导钾通道,KCNN4）的活性;另有报道PDI可增加小鼠海马神经元NMDA受体功能、增加海马神经元兴奋性并参与癫痫发生。但是对于PDI是否能影响DRG神经元的兴奋性还不清楚。所以我们拟在完成上述整体动物行为学实验后,通过体外制备重组蛋白二硫键异构酶hPDI,应用膜片钳技术研究其对DRG神经元兴奋性和部分离子通道功能的影响,以探究其对疼痛调节作用的分子机制。第一部分DRG痛觉神经元特异性敲除PDI对小鼠疼痛行为的影响目的:使用Cre-loxP重组酶系统条件性敲除DRG中表达Nav1.8钠通道痛觉神经元中的PDI,研究DRG痛觉相关神经元中PDI在疼痛发生过程中的作用。方法:（1）SNS（Nav1.8）-Cre小鼠[Cre重组酶在Scn10a的启动下表达]与PDI-loxP小鼠[Pdi的外显子1和外显子2位于loxP位点之间]交配繁殖及基因型鉴定,利用冰冻切片和免疫荧光技术鉴定DRG组织PDI敲除效率。（2）应用Von Frey纤维刺痛针和热辐射刺痛仪（Hargreaves）,测定SNS-Cre,PDIfl/fl小鼠（实验组）和PDIfl/fl小鼠（对照组）机械刺痛和热刺痛阈值。（3）急性疼痛模型:小鼠右后脚掌注射BK（200μM,25μl）,录制视频,观察小鼠疼痛反应,记录舔脚时间和舔脚次数。（4）慢性疼痛模型:小鼠右后脚掌注射CFA（20μl）,观察14天内小鼠对机械刺激和热刺激的痛觉过敏行为。（5）统计方法:Mann-Whitney U检验,t’检验和单因素重复测量方差分析。结果:（1）转基因小鼠交配繁殖及基因型鉴定:将SNS-Cre转基因小鼠与PDIfl/+转基因小鼠交配得到SNS-Cre,PDIfl/+杂合子小鼠后,再与PDIfl/+小鼠交配得到SNS-Cre,PDIfl/fl小鼠,即DRG痛觉神经元特异性敲除PDI的转基因小鼠。小鼠出生后10天,剪脚趾标记并剪鼠尾提取基因组DNA,通过PCR扩增和凝胶电泳检测目的DNA条带。Cre基因的目的条带约350 bp,PDI的WT条带约450 bp,PDI的Flox条带（插入loxP位点的目的条带）约550 bp。（2）DRG组织PDI的敲除效率:制备SNS-Cre,PDIfl/fl和PDIfl/fl小鼠DRG组织冰冻切片,通过免疫荧光技术检测敲除效率。结果显示PDI在PDIfl/fl小鼠DRG神经元有较高水平表达,在SNS-Cre,PDIfl/fl转基因小鼠DRG神经元中明显降低。（3）行为学结果:在基础状态下,与PDIfl/fl小鼠相比,SNS-Cre,PDIfl/fl小鼠的机械刺痛阈值显著性增高（P<0.01）,但热刺痛阈值与PDIfl/fl小鼠无显著差别;在急性炎性痛时（通过右后脚掌皮下注射BK,录制视频,观察15 min内小鼠的疼痛反应）,SNS-Cre,PDIfl/fl小鼠的舔脚时间和舔脚次数均较PDIfl/fl小鼠显著降低（P<0.05）;慢性炎性痛时（右后脚掌皮下注射CFA,在给药前1天和给药后第1,3,5,7,9,13,14天测定机械刺痛和热刺痛阈值）,两组小鼠的机械刺痛阈值和热痛刺痛阈值没有显著性差异。结论:DRG神经元中的PDI在维持DRG神经元产生和（或）传递疼痛信号功能方面有重要的作用;条件性敲除PDI可显著降低小鼠对机械刺痛的敏感性并可缓解急性炎性疼痛症状。第二部分纯化hPDI活性蛋白对DRG神经元兴奋性的影响目的:应用膜片钳技术研究体外纯化hPDI活性蛋白对DRG神经元兴奋性以及M型钾电流和T型钙电流的作用,探究PDI对疼痛作用的分子机制。方法:（1）体外大肠杆菌扩增方法制备重组蛋白二硫键异构酶hPDI;通过测定hPDI对Di-E-GSSG还原能力检测蛋白活性。（2）应用膜片钳技术观察hPDI对分离培养的DRG神经元兴奋性、M型钾电流和T型钙电流的作用。（3）统计方法:配对t检验和两样本t检验。结果:（1）重组蛋白二硫键异构酶hPDI的制备及活性检测:通过体外大肠杆菌扩增方法共制备重组蛋白hPDI 4批（C1-C4）,C1=3.5 mg/ml、C2=2.1 mg/ml、C3=1.9 mg/ml、C4=2.7 mg/ml;以Di-E-GSSG为底物加入重组蛋白hPDI（100 nM）可还原二硫键产生EGSH,通过测定EGSH含量检测重组蛋白hPDI的还原活性。检测结果显示第二次和第四次蛋白还原活性接近且较高,第一次和第三次蛋白活性较低。因此,后续电生理实验使用第二次和第四次制备的重组蛋白hPDI。（2）hPDI对DRG神经元兴奋性的影响:通过重力给药系统,细胞外给予hPDI（100 nM）可使DRG神经元静息膜电位显著去极化（P<0.01）,诱发动作电位个数显著增加（P<0.01）。同时,我们选用突变PDI两个活性位点CGHC为SGHS的PDIoooo（100 nM）进行对照实验。结果显示PDIoooo（100 nM）可使静息膜电位有轻微去极化,诱发动作电位个数也略增多。但hPDI使DRG神经元静息膜电位去极化的幅度显著高于PDIoooo,具有统计学差异（P<0.05）。（3）hPDI对DRG神经元M型钾电流和T型钙电流的影响:hPDI对M型钾电流大小和T型钙电流幅度没有直接影响。结论:PDI可以使DRG神经元去极化,提高其兴奋性;PDI上述作用可能不是通过对M型钾通道或T型钙通道的调节作用。PDI的两个活性位点CGHC可能在PDI发挥功能中起关键作用。